2，4，6-三氯苯酚對污泥性能和菌群結構的影響

李 玉，李剛強，徐永貴，趙建國，張 珂，金寶丹

（1. 鄭州輕工業大學 材料與化學工程學院環境污染治理與生態修復河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001；2. 鄭州航空港區明港水務有限公司，河南 鄭州 450001；3. 河南省對外科技交流中心，河南 鄭州 450001）

鋼鐵、制藥、紡織、造紙等行業廢水以及垃圾焚燒、農藥降解和水體氯消毒等過程產生的廢水中均含有多種氯酚類污染物［1-3］，質量濃度高達幾十至上百mg/L［4］。一些市政污水和污染水體中的氯酚含量也在μg/L到mg/L范圍內［5］。氯酚類化合物可通過食物鏈向高等生物體內轉移，即使是低濃度的氯酚進入人體，也會對其免疫、神經、呼吸等系統產生毒性作用［6］。因此，氯酚類化合物已被許多國家列為優先控制污染物，我國頒布的《生活飲用水衛生標準》（GB 5749—2006）［7］也將其列為常規水質監測項目。

通常選用活性污泥工藝處理含氯酚廢水，在降解廢水中氯酚類污染物的同時可去除其他污染物［8］。為實現活性污泥中降解氯酚的優勢菌群快速富集，可在氯酚廢水處理過程中投加易降解碳源，通過共代謝的方式去除氯酚。但碳源類型及添加比例會引起污泥絮體結構和菌群結構發生改變［8］。另外，可通過采用不同的反應器以及調整運行參數等手段提高活性污泥的抗沖擊和耐受能力，進而更有效地降解氯酚［5，9］。廢水中污染物的降解是通過微生物代謝過程中產生的酶實現的，氯酚類污染物在降解過程中會產生過量自由基，可導致蛋白質失活、脂質過氧化和DNA損傷等［10-11］。而微生物產生的過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）可清除自由基，在維持微生物活性方面起到重要作用［12］。脫氫酶（DHA）活性可用來表征污染物的降解程度［13］。

本研究采用序批式生物反應器（SBR）處理進水質量濃度為10 mg/L的2，4，6-三氯苯酚（2，4，6-TCP）模擬廢水，考察2，4，6-TCP對污泥性能和菌群結構的影響，以期為含氯酚廢水的處理提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

2，4，6-TCP（純度大于98.0%），Tokyo化工有限公司提供；HPLC級甲醇（純度大于99.9%），北京京科瑞達科技有限公司；碳酸氫鈉、鹽酸、磷酸、高錳酸鉀、磷酸二氫鉀和重鉻酸鉀等：均為分析純。

LC-10ATVP型高效液相色譜儀：日本島津公司；ICS 1000型離子色譜儀：美國瓦里安儀器公司；TGL-20bR型高速低溫離心機：上海安亭科學儀器廠；Five Easy TM型pH計：瑞士METTLER TOLEDO公司；YSI Pro1020型便攜式溶解氧（DO）計：美國YSI公司。

1.2 污泥接種及SBR運行

取市政污水處理廠曝氣池污泥，用自來水清洗3次并曝氣24 h后接種至有效體積為5 L的2個圓柱形SBR中，SBR的外徑和高度分別為20 cm和25 cm。混合液懸浮固體濃度（MLSS）和污泥體積指數（SVI）分別為2.5 g/L和90 mL/g。實驗期間，模擬廢水中的碳源由甲醇提供，進水COD為（300 ±20）mg/L。模擬廢水中補充微生物代謝所需的氮、磷和金屬元素［8］。

采用碳酸氫鈉溶液和稀鹽酸溶液調整進水pH為7.2±0.4。實驗組SBR投加進水質量濃度為10 mg/L的2，4，6-TCP，對照組SBR則不投加2，4，6-TCP。SBR每天運行2個周期，每個周期12.00 h，包括進水0.15 h，運行11.00 h，靜置0.70 h和排水0.15 h。采用定時開關控制SBR運行期間為間歇曝氣，曝氣與不曝氣時間均設置為2.00 h，DO為（1.5±0.5）mg/L，并通過攪拌使DO與活性污泥充分接觸。2個SBR共計運行76 d。

1.3 分析方法

采用pH計和DO計定期測定SBR運行過程中的pH和DO；采用重鉻酸鹽法［14］和重量法［15］分別測定出水COD和MLSS；采用高效液相色譜儀測定水相和泥相中的2，4，6-TCP質量濃度；采用離子色譜儀測定水相中Cl-質量濃度。

1.4 酶活性分析

取SBR泥水混合液在12 000 r/min和4 ℃條件下高速低溫離心5 min，棄去上清液，用磷酸緩沖液清洗污泥3次，所得污泥用于酶活性的測定。采用高錳酸鉀滴定法測定CAT活性［16］；采用加入人工受氫體氯化三苯基四氮唑（TTC）的方法測定DHA活性［16］；采用購自南京建成科技有限公司的試劑盒測定SOD活性。每個樣品的酶活性測定重復3次。

1.5 菌群結構分析

當實驗組SBR運行結束后，采用溶酶菌-SDS-氯仿異戊醇法提取污泥的基因組DNA［17］。細菌16 S擴增上游引物（357-F-GC）和下游引物（518r）序列分別為5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCG GGGCGGGGGCACGGGGGGGGCCTACGAGGC AGCAG-3’，5’- ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。按照BioLinker公司提供的說明書進行PCR反應和Reconditioning PCR反應，其擴增產物通過40%～60%的變性梯度凝膠電泳分離，電泳結束后對凝膠染色、拍照，并用滅菌刀切割優勢條帶。

采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN）回收切割條帶中的PCR產物，該產物的二次擴增引物去掉GC發夾結構，利用BioLinker公司的pED-T載體試劑盒克隆PCR產物。挑選平板上的克隆，用Amp抗性LB培養基培養，待菌液濃度培養至OD600值為2～3時，對菌液進行PCR擴增，擴增產物由上海BioSune 生物技術有限公司進行測序和整理。為保證測序結果的準確性，每個樣品做3個平行實驗。

2 結果與討論

2.1 SBR出水COD隨運行時間的變化情況

SBR出水COD隨運行時間的變化見圖1。考慮到溫度顯著影響微生物的代謝［18］，故從運行第10天開始利用加熱棒控制SBR的水溫為（25±1）℃，發現對照組SBR出水COD短暫升高，表明微生物需要一定的時間來應對水溫的突然升高。此后，對照組SBR出水COD逐漸降低并趨于穩定。從22 d至運行結束，其出水COD在（85.7±14.0）mg/L的范圍內波動。

圖1 SBR出水COD隨運行時間的變化

SBR運行1～14 d，實驗組SBR出水COD逐漸升高，在第14 天時達到292.8 mg/L，推斷認為進水中的2，4，6-TCP顯著抑制污泥活性；運行14～60 d，SBR出水COD逐漸降低，60 d后COD在（143.0±7.6）mg/L的范圍內波動。在整個SBR運行階段，實驗組SBR的出水COD顯著高于對照組，表明2，4，6-TCP的毒性持續影響污泥活性。

2.2 MLSS隨運行時間的變化情況

MLSS隨運行時間的變化見圖2。由圖2可見：對照組SBR的MLSS在2.5 g/L附近上下波動；實驗組SBR的MLSS隨運行時間逐漸降低，在第25天時低至1.6 g/L；隨著運行時間的延長，降解2，4，6-TCP的優勢菌逐漸富集，污泥活性部分恢復。在整個SBR運行階段，實驗組SBR的MLSS一直低于對照組，這是因為氯酚類化合物是一類解偶聯劑，可抑制微生物的代謝生長［19］。

圖2 MLSS隨運行時間的變化

2.3 2，4，6-TCP質量濃度隨運行時間的變化情況

實驗組SBR水相和泥相中2，4，6-TCP質量濃度隨運行時間的變化見圖3。由圖3可見：運行1～15 d，水相和泥相中積累的2，4，6-TCP質量濃度均逐漸升高，兩者之和超過進水的10 mg/L，這是因為進水中的2，4，6-TCP逐漸積累至泥相還未被降解；運行15～70 d，隨著降解2，4，6-TCP的優勢菌的富集，進水中的2，4，6-TCP逐漸被降解，水相和泥相中2，4，6-TCP的質量濃度顯著下降；至SBR運行結束，水相和泥相中仍可檢測到2，4，6-TCP的殘留，這是因為2，4，6-TCP的毒性和難降解特性導致其去除較慢。

圖3 實驗組2，4，6-TCP質量濃度隨運行時間的變化

2.4 活性污泥的SEM表征結果

對照組SBR活性污泥和實驗組SBR活性污泥的SEM照片見圖4。由圖4可見：實驗組SBR活性污泥表面被微生物分泌的黏性物質包裹；而對照組SBR活性污泥中的微生物則聚集成簇，單個微生物清晰可見。這是因為為抵抗2，4，6-TCP的毒性作用，活性污泥中的微生物分泌了大量的胞外聚合物。而已有的研究也證實了氯酚類化合物會誘導活性污泥分泌胞外聚合物［15］。

圖4 對照組SBR活性污泥（a）和實驗組SBR活性污泥（b）的SEM照片

2.5 單個SBR周期中2，4，6-TCP和COD的去除情況

當實驗組SBR運行至第72天時，單個SBR周期不同時間點的COD、2，4，6-TCP質量濃度和Cl-質量濃度見圖5。由圖5a可知：對照組SBR進水中的COD被快速降解，在9.00 h時COD最低（42.0 mg/L），12.00 h時略有升高（72.0 mg/L），推斷認為甲醇屬于易降解碳源，前6.00 h被快速降解，12.00 h時升高則是由部分微生物因死亡釋放碳源引起；實驗組SBR進水COD的降解情況顯著低于對照組，在9.00 h時達到最低（88.0 mg/L），12.00 h時同樣略有升高，為148.0 mg/L。由圖5b可見，隨著COD的降解，進水2，4，6-TCP吸附至污泥被降解，積累至污泥的最大2，4，6-TCP質量濃度出現在3.00 h（2.87 mg/L），水相中Cl-質量濃度的升高也表明2，4，6-TCP被有效地降解，2，4，6-TCP降解過程中釋放的Cl-證實部分氯代轉化產物存在于SBR中。推斷認為，雖然降解2，4，6-TCP的優勢菌隨運行時間的延長而富集，但2，4，6-TCP及其轉化產物的毒性會長期抑制污泥活性，導致其出水COD高于對照組。在后續的研究中，可考慮采用延長運行時間或縮短HRT的方式來降解2，4，6-TCP，以及通過鑒定2，4，6-TCP降解過程的轉化產物推導其代謝路徑。

圖5 單個SBR周期中COD（a）和實驗組2，4，6-TCP質量濃度、Cl-質量濃度（b）隨運行時間的變化

2.6 單個SBR周期中酶活性的變化

當實驗組SBR運行至第72天時，單個SBR周期不同時間點的CAT、DHA和SOD活性見圖6。由圖6可見，實驗組污泥中CAT和DHA活性顯著升高，分別為對照組的1.29～1.58倍和1.56～1.93倍。這是因為經長時間馴化后，降解2，4，6-TCP的優勢菌富集，污泥活性逐漸恢復，DHA活性升高可有效降解廢水中的2，4，6-TCP。相關研究發現，氯酚類污染物降解過程中會產生多種有毒的轉化產物和次級代謝產物［10］，而較高的CAT活性可消除有毒物質對微生物的損傷。實驗組SBR的SOD活性在6.00 h時達到最大值，為對照組的1.49倍，其余時間略低于或與對照組相當。推斷認為，2，4，6-TCP在前6.00 h的降解導致有毒物質的過量積累，誘導SOD活性在單個SBR周期的6.00 h達到最大值，而后隨著有毒物質的降解，SOD活性降低。前期的相關研究也發現難降解有機污染物可誘導不同酶活性的升高，與本研究的結果一致［20］。

圖6 單個SBR周期中不同酶活性隨運行時間的變化

2.7 2，4，6-TCP對污泥菌群結構的影響

經檢測，對照組SBR污泥經不含2，4，6-TCP的模擬廢水馴化培養后，富集的優勢菌主要包括Chryseobacteriumsp.、Leadbetterellasp.、Erysipelothrixsp.、Pontibacillussp.、Boseasp.和Salimesophilobactersp.［17］。當實驗組SBR運行結束后，污泥中的優勢菌主要為Methylobacillussp.、Pseudomonassp.、Pseudoxanthomonassp.、Leadbetterellasp.、Achromobactersp.、Stenotrophomonassp.和Salimesophilobactersp.，2，4，6-TCP顯著改變了污泥的菌群結構。經2，4，6-TCP馴化富集的優勢菌大都具有降解氯酚類或芳香烴類污染物的能力［17，21-22］。另外，部分菌如Pseudoxanthomonassp.在代謝過程中可分泌表面活性劑等活性因子，可降低氯酚類污染物對微生物的毒害作用［23］。

3 結論

a）采用SBR處理2，4，6-TCP質量濃度為10 mg/L的模擬廢水，2，4，6-TCP的存在顯著抑制污泥活性。隨著運行時間的延長，污泥中降解2，4，6-TCP的優勢菌逐漸富集，污泥活性逐漸恢復，進水COD和2，4，6-TCP被有效降解。

b）進水2，4，6-TCP及其轉化產物的毒性會長期抑制污泥活性，為抵抗其毒性并將其降解，活性污泥中的微生物分泌了大量的胞外聚合物。污泥中CAT和DHA活性顯著升高，SOD活性在單個SBR周期的6.00 h達到最大值，而后隨著有毒物質的降解，SOD活性降低。

c）當實驗組SBR運行結束后，污泥中富集的優勢菌主要為Methylobacillussp.、Pseudomonassp.、Pseudoxanthomonassp.、Leadbetterellasp.、Achromobactersp.、Stenotrophomonassp.和Salimesophilobactersp.，大都具有降解氯酚類污染物的能力。