miR-203介導TNFα調控牙周膜干細胞成骨分化*

袁清敏 馮保靜 王國慶 劉會娟 王獻利

牙周炎作為一種高發病率的慢性炎癥疾病，是成年人牙齒脫落的主要原因［1，2］。近年來PDLSCs已被證明在小鼠移植時可形成異位牙骨質/韌帶樣復合體［3］。因此，研究炎癥微環境下PDLSCs成骨分化的分子機制具有重要意義。研究表明，腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNFα的過度釋放會導致牙周和骨組織的損傷，如牙槽骨缺損、牙槽窩缺損、牙支持組織缺損等［4］。此外，研究證實TNFα可抑制牙周膜干細胞的成骨向分化［5］。因此，深入研究炎癥微環境下hPDLSCs成骨向分化的調控機制在牙周膜干細胞的臨床應用具有重要作用。

MicroRNAs(miRNAs）已被證明參與調節人骨髓間充質干細胞的成脂和成骨分化［6］。我們前期研究也發現miR-203可通過靶向調控RUNX2進而抑制牙周膜干細胞成骨向分化能力［7］。然而炎癥狀態下miR-203對hPDLSCs成骨向分化的影響及其作用機制尚不明確。研究證實miR-203通過抑制TNFα及IL-24促炎因子的表達，從而抑制皮膚免疫反應［8］，表明在細胞分化過程中TNFα和miRNA之間存在潛在調控關系。因此，我們推測miR-203可能通過調控TNFα參與炎癥狀態下hPDLSCs的成骨分化。本研究將探索miR-203在炎癥微環境下對PDLSCs成骨向分化能力的影響及其機制，以期為牙周炎骨缺損提供新的機制和潛在的治療靶點。

1.材料和方法

1.1 實驗材料 胎牛血清（Gibco，美國）；胰蛋白酶（Hyclone，美國）；TNFα（Peprotech，美國）；α-MEM培養基（Hyclone，美國）；低溫高速離心機（Eppendorf，德國)，酶聯免疫檢測儀（BIO-TEK，美國）；離心機（Eppendorf，德國）；Ⅰ型膠原酶、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C(Sigma，美國)，RUNX2、ALP、OCN、OPN、TNFα及β-actin引物（生工，中國)，cDNA合成試劑盒、SYBR Green試劑盒（Takara，日本)；miR-203 mimics、miR-203 inhibitor(銳博，中國)；Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）；TNFα ELISA試劑盒（碧云天，中國）；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（碧云天，中國）。

1.2 細胞培養、轉染及礦化誘導 收集口腔頜面外科18-24歲志愿者即刻拔除的前磨牙或第三磨牙，要求牙齒健康完整，拔除牙齒在無菌條件下充分沖洗，并用手術刀片分離出牙齒根中段牙周膜組織，加入500μL濃度為4mg/L的Ⅰ型膠原酶37℃消化45min，每15min重懸一次，用完全培養基（含10%胎牛血清的α-MEM培養液）重懸并接種于6孔板中，于細胞培養孵箱內培養，待細胞長至80%融合率時，有限稀釋法挑選細胞單克隆株，傳代擴大培養后用于后續實驗。細胞饑餓培養12h后，按照預實驗得到的病毒滴度與細胞比例加入病例液（MOI=10），12h后更換培養基，培養48h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達情況，并通過qPCR鑒定轉染效率。

取P3代hPDLSCs消化、計數，以1.5×105個/孔的細胞密度接種于6孔培養板中，分為礦化誘導組和對照組（未礦化誘導組)，待細胞長至80%融合率時，更換為成骨誘導液（完全培養基、50mg/L維生素C、10nmol/L地塞米松和10mmol/L β-甘油磷酸鈉），誘導2周后通過qRCR檢測TNFα及成骨相關基因表達。

1.3 實時定量聚合酶鏈反應（qRCR）檢測mRNA的表達 取P3代hPDLSCs消化、計數，以1.5×105個/孔的細胞密度接種于6孔培養板中，待細胞長至80%融合率時，更換為成骨誘導液，并添加TNFα和miR-203作為刺激因素，實驗分為TNFα組（20ng/ml）、對 照 組、TNFα+miR-203組 及TNFα+miR-203 inhibitor組培養2周后，提取細胞總RNA，按照Prime Script?RT reagent Kit（Takara生物公司，日本）說明書逆轉錄合成cDNA。

q-PCR反應根據SYBR?Premix Ex TaqTM（Takara生物公司，日本）說明書操作，miR?203上游引物為：5′-GUGAAAUGUUUAGGACCACUAG-3′，下游引物為：5′-CCAGUGGUUCUUAACAGUUCAAC-3′；內參U6上游引物為：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下 游 引 物 為：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；TNFα上游引物為：5′-CCGGGCAACAATGTCCAAAAG-3′，下游引物為：5′-AGGACGACTGTTCAGCACG-3′；RUNX2上游 引 物 為：5′-GGGTAAGACTGGTCATAGGACC-3′，下游引物為：5′-CCCAGTATGAGAGTAGGTGTCC-3′；OCN上游 引物為：5′-GCCGAGGTGATAGTGTGGTT-3′，下 游 引 物 為：5′-ACTCCTCGCTTTCCATGTGT-3′；ALP上游引物為：5′-CCCACCTCAGGCTATGCTA-3′，下游引物為：5′-CACTGGGCAGACAGTCAGAA-3′；內參β?actin上 游 引 物 為：5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，下游引物為：5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。

1.4 茜素紅檢測miR-203及TNFα對hPDLSCs成骨分化能力的影響 取P3代hPDLSCs消化、計數，以1.5×105個/孔的細胞密度接種于6孔培養板中，待細胞長至80%融合率時，更換為成骨誘導液，并分為TNFα組（20ng/ml）、對照組、TNFα+miR-203組及TNFα+miR-203 inhibitor組，誘導2周后進行茜素紅染色：PBS輕柔漂洗細胞3次，棄PBS后加入4%的多聚甲醛固定細胞20min；棄多聚甲醛固定液，PBS輕柔漂洗細胞3次，棄PBS后加入茜素紅染液染色10min；PBS洗去殘留的茜素紅染液，顯微鏡下觀察并記錄鈣化結節的形成；加入10%氯化十六烷基吡啶孵育15min，充分釋放出染色的茜素紅，酶標儀檢測各組562nm處的OD值，以OD值作茜素紅染色定量分析。

1.5 雙熒光素酶報告基因實驗參照Lipofectamine 2000（Invitrogen，美國）說明書對hPDLSCs進行轉染，轉染篩選后48h后用于后續實驗。利用生物信息學預測發現TNFα為miR-203的潛在靶基因，為確定miR-203靶向結合于TNFα的3′UTR區，將TNFα突變型（TNFα-MUT）和野生型（TNFα-WT）3′UTR合成，并連接到psiCHENK-2載體質粒。在hPDLSCs中共轉染miR-203 mimics、miR-203-NC和TNFα質粒，轉染48h后冰上裂解細胞，檢測螢火蟲和海腎熒光素酶熒光強度并進行分析。

1.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA實驗）按照ELISA試劑盒（碧云天，中國）說明書步驟檢測TNFα組（20ng/ml）、對照組、TNFα+miR-203組及TNFα+miR-203 inhibitor組細胞上清液中TNFα水平，TNFα因子被固相捕獲后通過酶標儀檢測450nm處的吸光度值，繪制標準曲線，對照樣品吸光度值，即可計算出靶蛋白濃度。

1.7 統計學分析 采用Graph 5.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗或one-way ANOVA單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。通過樣品的吸光度值和標準曲線計算出樣品的相應濃度。

2.結果

2.1 牙周膜干細胞分化前后TNFα和成骨相關基因的表達 原代培養的細胞呈長梭形，圍繞組織塊呈放射狀排列（1A）；通過茜素紅染色對牙周膜干細胞礦化能力進行鑒定（1B）；qPCR檢測hPDLSCs分化前后TNFα和成骨基因mRNA的表達水平，結果顯示：hPDLSCs分化后TNFα的表達水平與對照組相比顯著下調（圖1C），而RUNX2、ALP、OCN、OPN的表達水平則明顯升高（圖1D），差異有統計學意義。

圖1 牙周膜干細胞礦化誘導后TNFα和成骨相關基因的表達（×10)

2.2 TNFα對牙周膜干細胞成骨分化能力及miR-203影響TNFα（20ng/ml）刺激牙周膜干細胞后通過茜素紅染色及qPCR檢測細胞成骨分化和miR?203表達情況，qPCR結果顯示TNFα刺激后牙周膜干細胞中成骨相關基因RUNX2、ALP、OPN、OCN mRNA的表達水平顯著下調，而miR?203的表達則明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.05)(圖2)。茜素紅結果顯示TNFα刺激后牙周膜干細胞中的礦化結節比對照組明顯較少，差異有統計學意義（P＜0.05)(圖2)。

圖2 TNFα抑制牙周膜干細胞成骨分化并上調miR-203的表達（×10)

2.3 miR-203 inhibitor逆轉TNFα對牙周膜干細胞成骨能力的抑制作用miR-203轉染牙周膜干細胞48h后可見細胞表達綠色熒光蛋白（圖3A）。qPCR驗證牙周膜干細胞轉染qPCR驗證牙周膜干細胞轉染miR-203 inhibitor和miR-203 mimics效果，結果顯示miR-203 mimics組中miR?203的表達顯著增加，而miR-203 inhibitor組結果相反，差異有統計學意義（P＜0.05)(圖3B)。TNFα刺激牙周膜干細胞并轉染miR-203后礦化誘導2周，結果顯示TNFα對牙周膜干細胞成骨能力有明顯抑制作用，而miR-203 inhibitor組則可逆轉TNFα對牙周膜干細胞成骨能力的抑制作用，而miR-203 mimics組則進一步抑制牙周膜干細胞成骨能力，差異有統計學意義（P＜0.05)(圖3C-E)。

圖3 miR-203 inhibitor可逆轉TNFα對牙周膜干細胞成骨能力的抑制作用（×10)

2.4 TNFα為miR-203的靶基因 通過生物信息學網站預測TNFα為miR-203的潛在靶基因，miR-203轉染后通過qPCR及ELISA實驗檢測hPDLSCs中TNFα水平，結果顯示miR-203 mimics組中的TNFα mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組，而miR-203 inhibitor則結果相反（圖4），說明TNFα可被miR-203負向調控。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示TNFα-WT+miR-203組的熒光比值顯著低于TNFα-WT+miR-NC組，差異有統計學意義（圖4）(P＜0.05)；而TNFα-MUT+miR-203組和TNFα-MUT+miR-NC組的熒光比值相比較差異無統計學意義（P＞0.05)。結果進一步確認TNFα是miR-203的靶基因，表明miR-203可與TNFα的3′-UTR區上的位點結合，并直接負向調控TNFα基因。

圖4 雙熒光素酶報告驗證TNFα為miR-203靶基因

3.討論

牙周炎發病過程中，炎癥不僅影響骨吸收和破骨細胞活性，而且還會抑制牙周膜干細胞形成新的牙周結締組織牙槽骨的能力［9］。研究表明炎性微環境可能導致干細胞功能缺失［10］。因此，PDLSCs成骨分化能力降低可能與牙周炎的發病機制有關［11］。研究發現與正常PDLSCs相比，炎癥來源的PDLSCs多向分化能力明顯減弱［2］。但炎癥微環境下PDLSCs分化能力降低的機制尚不清楚。研究發現miR-203負向調節TNFα及白細胞介素-24(IL24）等關鍵細胞促炎因子，進而抑制皮膚免疫反應。而我們前期研究表明抑制miR-203表達后可促進牙周膜干細胞成骨向分化，此外我們還發現miR-203可與RUNX2的3′-UTR區上的位點結合，表明miR-203與RUNX2存在直接負向調控關系。而RUNX2作為一種成骨向分化特異性轉錄因子，能調控眾多與成骨相關基因的轉錄［12］。因此，我們推斷miR-203在炎癥微環境下調控PDLSCs成骨向分化發揮著關鍵作用。

決定細胞命運相關的分子機制包括特定的信號通路和特定的轉錄因子，這些轉錄因子被細胞外信號順序激活。而在決定細胞命運的過程中，miRNAs是信號網絡和基因重編程不可或缺的調節因子。研究表明miRNAs是介導細胞分化的調節因子，靶向調控這些miRNAs可能是治療炎癥性疾病的一種十分具有前景的方法［13］。牙周炎作為一種慢性炎癥環境，我們預測它可能具有與正常生理狀態不同的miRNA表達譜。基于這一假設，我們檢測了hPDLSCs成骨分化過程中差異表達的miRNAs。結果顯示，正常情況下hPDLSCs在成骨分化過程中，miR-203及miR-124表達明顯上調［7，14］。而本研究發現在TNFα誘導的炎性微環境下，miR-203在hPDLSCs成骨分化過程中表達水平上調，提示miR-203可能在炎癥微環境下具有調控PDLSCs成骨分化的重要作用。研究發現TNFα是導致牙周炎的主要細胞因子之一，TNFα水平的升高被證實與牙周病的嚴重程度和免疫反應有關［15］。TNFα可通過抑制骨形成和促進骨吸收促進牙周炎的發生［16］。然而，也有報道稱TNFα能促進人骨髓間充質干細胞的成骨分化，并證明TNFα通過增強肌肉源性基質細胞的募集和分化促進骨折修復［17］。因此，TNFα在干細胞成骨分化中的作用是復雜的、雙相的。大量研究顯示TNFα體外刺激牙周膜干細胞的濃度在10-100ng/ml之間，多數文獻選擇的刺激濃度是10-20ng/ml［16，18，19］。本實驗通過預實驗檢測了0、10、20、50、100ng/ml TNFα對牙周膜干細胞中成骨相關基因的影響，發現20ng/ml TNFα可顯著下調成骨基因，故本實驗選擇了20ng/ml作為刺激濃度。為研究miR-203調節炎癥微環境下PDLSC成骨分化潛在的分子機制，我們尋找與miR-203相關的潛在成骨目標基因，發現miR-203可靶向調控Runx2進而抑制牙周膜干細胞成骨向分化［7］。此外，我們還發現TNFα也可被miR-203靶向調控，結果與文獻報道相一致［8］。值得注意的是，miR-203在PDLSCs炎癥微環境中顯著上調，而高表達miR-203則抑制TNFα的產生，從而形成了miR-203-TNFα負反饋循環。此外，雙熒光素酶報告實驗證實TNFα含有miR-203結合位點，該位點位于3′-UTR中并與miR-203序列互補，這意味著miR-203可靶向TNFα進而調控PDLSCs的成骨向分化。

本研究首次探索了炎癥微環境下miR-203對hPDLSCs成骨分化能力的影響，研究結果顯示TNFα刺激下可上調hPDLSCs中miR-203的表達并抑制hPDLSCs的成骨分化能力，兩者的表達呈負相關。此外，在TNFα誘導的炎癥微環境下抑制miR-203的表達可逆轉TNFα對hPDLSCs成骨向分化的抑制作用。雙熒光素酶報告實驗進一步證實TNFα是hPDLSCs中miR-203的直接靶點。miR-203可以直接靶向TNFα負向調控PDLSCs成骨向分化。值得注意的是，在炎癥環境中TNFα可以通過靶向miR-203形成負反饋循環，從而抑制PDLSC的成骨向分化。這些結果提示miR-203/TNFα功能軸形成的負反饋環路在炎癥微環境下hPDLSC的成骨分化過程中發揮關鍵作用。綜上，本研究證實了在炎癥微環境下TNFα通過靶向miR-203負向調控hPDLSCs的成骨向分化能力，提示miR-203具有重建牙周炎損傷的牙周組織的潛力，研究為牙周炎和其他炎癥性疾病的治療策略提供分子基礎。