雌激素濃度對大鼠髁突軟骨細胞中雌激素受體表達的影響*

張娟 王江紅 張帥 田利杰 王寶利 李長義

特發性髁突吸收（idiopathic condylar resorption，ICR）是一種特發于顳下頜關節軟骨及軟骨下骨的退行性病變，發病人群主要為15~35歲的青少年，尤其是青春期生長驟增期間［1］，男女比例約1∶9［2］。ICR主要臨床癥狀包括下頜支發育短小、前牙開及面下1/3發育不足等，阻礙青少年的頜面部發育，影響青少年的身心健康。髁突作為下頜骨生長發育中心之一，當ICR發生時，髁突發育受抑制，關節軟骨及軟骨下骨可見破壞。錐形束CT（Cone beam Computer Tomography，CBCT）檢查可見，髁突發生退行性變，骨皮質吸收不完整［3］，髁突垂直發育不良，表現為髁突高度降低，髁寬變小［4］，隨著病情的進展，髁突形態改變會愈發明顯［5］。從結構上看，髁突表面覆蓋纖維軟骨，軟骨細胞不僅能表達Ⅱ型膠原蛋白保持軟骨細胞的彈性功能，使髁突有足夠能力緩沖外界給予的壓應力；還有增殖、分化、骨化成骨的作用，促進下頜骨的生長發育。

人類流行病學調查及動物實驗等證明，ICR的發生與雌激素水平異常密切相關［6，7］，雌激素濃度過高或過低均不利于軟骨細胞的增殖分化，且雌激素對髁突軟骨細胞的作用呈時間依賴性［8，9］，但目前未有研究得出有利于髁突軟骨細胞增殖的確切雌激素濃度。基因及蛋白水平研究表明，雌激素受體（estrogen receptor，ER）α、β在髁突軟骨細胞中表達，其中，ERα在髁突軟骨的過渡層和肥大層表達較多，且分布于軟骨細胞內，ERβ大多表達于髁突軟骨的肥大層，且集中分布在軟骨細胞的細胞核中［10］。雌激素在生理水平會上調髁突軟骨細胞ERα表達，下調ERβ表達，在10-9mmol/L雌激素濃度下，E2最能上調ERα基因表達［11］。另有研究證明，當雌激素水平降低時，髁突軟骨細胞中ERα、β的表達會同時下降［12］，但上述研究只是單方面證明雌激素濃度變化對某一基因表達的影響，且實驗分組雌激素濃度變化跨度大。故本實驗設計雌激素濃度變化跨度小，旨在探討能促進髁突軟骨細胞增殖的最佳雌激素濃度，以及雌激素濃度變化對ERs及Col II表達的影響。

1.材料與方法

1.1 材料4周齡雌性SD大鼠（斯貝福）、雌激素（MCE）、CCK-8試劑盒（MCE）、ERα抗體（Bio-oss）、ERβ抗體（ABclonal）、Col II抗體（Proteintech）。

1.2 提取原代髁突軟骨細胞及細胞鑒定 獲取4周齡雌性SD大鼠髁突軟骨塊，胰酶-膠原酶分步消化法提取髁突軟骨細胞并進行細胞接種及原代培養，光學顯微鏡下觀察提取細胞的形態，配置甲苯胺藍工作液進行細胞鑒定：10%中性甲醛固定軟骨細胞后，ddH2O沖洗，隨后用甲苯胺藍染色2h，置于顯微鏡下觀察。

1.3 細胞生長曲線測定 據細胞培養時對細胞生長速度的觀察，細胞增殖速度從第一代開始逐漸加快，傳至第四代后逐漸減慢。當原代軟骨細胞傳至第三代時，待髁突軟骨細胞達到70%~80%滿底時，0.25%胰酶消化，后用含20% FBS的DMEM培養基終止消化并將其配制成密度為1×105個/mL的細胞懸液，接種于6孔板內，繼續培養。培養24h后分別計數3孔的細胞數，每孔計數3次，取3孔細胞數的均值作為其計數時的細胞數。以后每隔24h分別計數3孔的細胞數，共計數7d，并繪制細胞生長曲線。

1.4 雌激素濃度改變對細胞增殖的影響 二甲基亞砜（DMSO）溶解雌激素，配制成不同濃度的雌激素溶液。當原代細胞傳至第三代時，將細胞重懸、接種至96孔板中，37℃恒溫箱中培養24h，細胞貼壁伸展后，進行不同干預。處理因素分為空白組（只含培養基）、對照組（軟骨細胞無干預）、DMSO組、不同雌激素濃度干預組（10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L），其中DMSO組及不同雌激素濃度干預組所含DMSO濃度均為0.1%。干預24h后，快速加入CCK-8液10μL，37℃恒溫箱孵育2h后，酶標儀測定其在450nm處的吸光度，根據公式計算軟骨細胞增殖率。

細胞增殖率=（實驗組-空白組）/（對照組-空白組）×100%

1.5 不同濃度雌激素干預及相關基因mRNA和蛋白檢測 當原代軟骨細胞傳至第三代時，將細胞重懸、分別接種至24孔板和6孔板中，37℃恒溫箱培養24h，待細胞貼壁伸展后，進行不同干預，處理因素分為對照組（軟骨細胞無干預）、DMSO組、不同雌激素濃度干預組（10-12mol/L、10-11mol/L、10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L）。其中DMSO組及不同雌激素濃度干預組所含DMSO濃度均為0.1%。分別干預24h后，提取軟骨細胞mRNA和蛋白，應用RT-PCR和WB技術檢測ERα、ERβ、Col II基因和蛋白表達量的差異。應用image J軟件分析ERα、ERβ、Col II蛋白條帶的灰度值，先計算目的蛋白灰度值與對應分組β-actin蛋白灰度值的比值后，將對照組相對值設為1，計算相對表達量后形成柱狀圖。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT‐PCR引物序列

1.6 統計學分析 應用SPSS 23.0軟件對所得數據進行統計學分析，所有實驗均重復三次及以上，所得數據均用均數±標準差表示（xˉ±s）。組間比較采用t檢驗，當P＜0.05時認為組間存在顯著性差異。

2.結果

2.1 細胞形態觀察及細胞鑒定 提取髁突軟骨細胞后，顯微鏡觀察，剛接種的軟骨細胞呈圓形，大約2h后貼壁，24h后，軟骨細胞會伸出許多觸角，形態呈多角形（圖1）。此后，細胞密度逐漸增加，至7d左右長滿培養皿底部。甲苯胺藍染色可見胞質淡藍染，胞核深藍染。甲苯胺藍染色結果證明提取的細胞是大鼠髁突軟骨細胞。

圖1 顯微鏡下髁突軟骨細胞形態觀察

2.2 測定細胞生長曲線 利用提取的原代軟骨細胞測定細胞生長曲線，如圖所示（圖2），軟骨細胞增殖在前兩天處于平臺期（P＞0.05）；從第2d進入對數生長期，至第5d生長逐漸緩慢。

圖2 髁突軟骨細胞生長曲線

2.3 雌激素濃度對軟骨細胞增殖的影響CCK-8測定軟骨細胞增殖率結果顯示（圖3），與DMSO組相比，10-10~10-7mol/L的雌激素能促進髁突軟骨細胞增殖（P＜0.05），當雌激素濃度在10-9mol/L時，對軟骨細胞促增殖作用優于其他組。以DMSO為溶劑不會影響髁突軟骨細胞的增殖。

圖3 CCK-8試劑盒測定髁突軟骨細胞增殖率

2.4 雌激素濃度對軟骨細胞基因表達影響

RT-PCR及WB結果表明，雌激素濃度變化對大鼠髁突軟骨細胞不同基因的表達量會產生不同影響，DMSO組與對照組相比，DMSO的加入能促進ERα、β和Col II表達，所以實驗組應與DMSO組進行比較，并做統計學分析。故與DMSO組相比較，雌激素對ERα及Col II的表達表現為促進作用，10-11~10-9mol/L的雌激素促進ERα的表達，10-9mol/L的雌激素對ERα的促表達作用優于其他組；當雌激素濃度為10-8~10-6mol/L時，能促進Col II的表達，10-7mol/L的雌激素對Col II表達的促進作用優于其他組；而10-10mol/L的雌激素會對ERβ的表達產生抑制作用（圖4、5），以上結果均有統計學意義（P＜0.05）。如圖6所示，ERα、ERβ、Col II蛋白表達的灰度值分析也得出如上結果。因此，10-8~10-7mol/L的雌激素既有利于髁突軟骨細胞增殖，又能促進Col II表達。

圖4 RT-PCR檢測大鼠髁突軟骨細胞ERα、ERβ、Col2 a1 mRNA表達

圖6 ERα、ERβ、Col II蛋白表達的灰度值分析

10-10mol/L vs DMSOP=0.0002，10-9mol/L vs DMSOP＜0.0001，10-8mol/L vs DMSOP＜0.0001，10-7mol/L vs DMSOP=0.0036。

ERα：DMSO與conP=0.0019，10-11mol/L與DMSOP=0.0289，10-10mol/L與DMSOP=0.0270，10-9mol/L與DMSOP=0.0169；

ERβ：DMSO與conP=0.0056，10-10mol/L與DMSOP=0.0092，10-6mol/L與DMSOP=0.0138；

Col2a1：DMSO與conP=0.0112，10-8mol/L與DMSOP=0.0468，10-7mol/L與DMSOP=0.0014，10-6mol/L與DMSOP=0.0350。

圖5 蛋白免疫印跡檢測大鼠髁突軟骨細胞ERα、ERβ、Col II蛋白的表達

3.結論

本實驗利用胰酶-膠原酶聯合消化法成功提取4周齡雌性SD大鼠髁突軟骨細胞。并應用分組跨度較小的雌激素濃度分組來進行了軟骨細胞增殖及相關基因表達測定的體外實驗。實驗證明，與對照組相比，10-9mol/L的雌激素對髁突軟骨細胞增殖及ERα表達的促進作用優于其他組；10-7mol/L的雌激素對Col II的促表達作用優于其他組；而雌激素濃度的變化會對ERβ的表達產生抑制作用，10-10mol/L最為顯著。雌激素促進髁突軟骨細胞增殖和ERα、Col II基因表達，而在這些濃度下抑制ERβ基因和蛋白的表達。

4.討論

本實驗研究證明，與DMSO組相比，10-9mol/L的雌激素對髁突軟骨細胞增殖和ERα基因的促表達作用優于其他組；10-7mol/L的雌激素對Col II表達的促進作用優于其他組；而雌激素濃度的變化會對ERβ的表達產生抑制作用，10-10mol/L最為顯著。以往研究雌激素濃度分組跨度大，基本為10-12mol/L~10-6mol/L［11］或10-12mol/L~10-4mol/L［13］，本實驗基于以往研究的雌激素濃度分組［11］，制定了一組雌激素濃度跨度較小的分組，進行更精確的實驗研究。國內外均有學者證明，不論是在大關節包括膝關節或椎間盤，還是針對顳下頜關節髁突軟骨細胞，正常生理濃度的雌激素對關節軟骨及軟骨細胞有保護作用，調控關節軟骨細胞的生物學功能和基因表達［14-16］，雌激素濃度過高或過低均不利于軟骨細胞的增殖［17-19］。但未有研究給出有利于軟骨細胞增殖的確切雌激素濃度。基于本實驗的雌激素濃度分組證明，10-9mol/L的雌激素最能促進軟骨細胞的增殖，隨著雌激素濃度的增高或降低，雌激素對軟骨細胞增殖的促進作用逐漸減弱，這與以往研究結果相符。

雌激素主要通過ERα通道調節軟骨形成、骨生長和生長板成熟［20，21］，關于基因表達的既往研究表明10-9mol/L的雌激素濃度最能促進SD大鼠髁突軟骨細胞ERα的表達［11］，本實驗與其結果一致。但在以往的研究中，雌激素濃度分組跨度大，不精確，且只測定了ERα mRNA的表達。從本實驗RT-PCR結果可看出，10-11~10-9mol/L的雌激素能促進ERα基因的表達，10-9mol/L濃度的雌激素對ERα基因的促表達作用優于本實驗其他分組，WB結果也表明，當雌激素濃度為10-11~10-9mol/L時，ERα蛋白表達量明顯增加，10-9mol/L增加較其他組明顯，且隨著雌激素濃度的升高或降低，ERα mRNA及蛋白表達量逐漸減低，說明雌激素對ERα基因表達具有雙向調節作用。

Col II是由軟骨細胞產生的，主要存在于關節、骨骼和肌腱等組織中的有減震、緩沖作用的重要物質。正常水平的雌激素能促進Col II表達，10-7M劑量下的雌激素能最大限度地促進Ⅱ型膠原蛋白的表達［21］，本實驗結果與其一致。但有實驗證明，雌激素以時間和劑量依賴性方式通過ERβ通路抑制小鼠椎間盤生長板軟骨細胞的增殖、分化，降低Ⅱ型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖的表達，發揮抑制作用的最佳雌激素濃度為10-7/-6M［22］，即雌激素可通過ERβ通路調節Col II的表達，與本實驗結果相反。本實驗研究證明10-10mol/L的雌激素對ERβ具有抑制作用，而雌激素促進Col II表達時，對ERβ的促進作用并不明顯，可能是由于上述實驗研究的是小鼠椎間盤軟骨細胞，而本實驗為SD大鼠髁突軟骨細胞，實驗動物品系及研究部位不同，可見雌激素對不同品系的生命體軟骨細胞的作用可能不同，故而對人髁突軟骨細胞的研究更加迫在眉睫。

通過本實驗研究證明，10-9mol/L的雌激素能促進大鼠髁突軟骨細胞增殖和基因ERα表達，10-7mol/L濃度的雌激素能促進Col II表達，而雌激素對ERβ促進作用并不明顯，并在10-10mol/L時抑制其表達。對于髁突軟骨組織來說，ERs是雌激素作用于軟骨細胞的經典核受體通路，Col II是軟骨細胞產生的能夠使軟骨組織對抗外界壓應力的主要物質，探索雌激素濃度變化對ERα、β及Col II基因表達影響的基礎研究對于ICR的預防和治療具有一定的臨床意義。