水稻褐飛虱若蟲和成蟲褪黑素含量測定及比較

施龍清，解振興，姜照偉，董 萌，占志雄

（福建省農業科學院水稻研究所，福建 福州 350018）

0 引言

【研究意義】褐飛虱Nilaparvata lugens（St?l）是水稻最主要害蟲之一。作為專食性昆蟲，一方面褐飛虱的若蟲和成蟲棲息在水稻莖基部刺吸汁液危害，另一方面雌蟲交配后將卵排列產于稻株韌皮部內，破壞水稻疏導組織。危害嚴重時，稻株大面積枯萎倒伏塌陷，導致減產甚至絕收。已知褪黑素在水稻中含量相對較高，且在重要激素合成和水稻抗性方面具有重要作用[1-3]。【前人研究進展】褪黑素（melatonin），化學名稱為N-乙酰5-甲氧基色氨，為血清素（serotonin，5-羥色氨）的衍生物，是一種吲哚類內分泌激素[4]。最早在牛的松果體中發現，后續研究證實所有脊椎動物體內均存在有褪黑素，并且除松果體外，其他器官如視網膜、晶狀體、骨髓細胞、腸道及皮膚等也能夠分泌褪黑素[5]。1984 年，Vivien-Roel 等利用放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）從蝗蟲的復眼中檢測到褪黑素，首次證明褪黑素同樣存在于昆蟲體內[6]。此后，陸續在半翅目（Hemiptera）、蜻蜓目（Odonata）、蜚蠊目（Blattodea）、直翅目（Orthoptera）、鱗翅目（Lepidoptera）、膜翅目（Hymenoptera）以及雙翅目（Diptera）等昆蟲中發現[7]。研究表明褪黑素在昆蟲晝夜節律、胚胎發育、蛻皮和繁殖等重要生命活動中不可或缺[8-11]。以果蠅Drosophila melanogaster為例，在人為注射褪黑素后，其交配速度和產卵量均顯著降低[12]。作為一種內源性激素，褪黑素在昆蟲體內的含量極低，且主要集中于頭部復眼內[7,13]。如蝗蟲Locusta migratoria單只復眼的褪黑素含量僅有10.5～26.5 pg[6]，100 mg重量的豌豆蚜蟲Acyrthosiphon pisum褪黑素含量為52.5～78.0 pg[14]。昆蟲褪黑素檢測的方法包括放射免疫測定法（radioimmunoassay，RIA）、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和酶聯免疫法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA），以及高效液相色譜-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）等[15-17]。相對來講，在這些方法中LC-MS 檢測具有靈敏度高、檢測速度快、費用低、結果穩定等特點，逐步成為檢測生物體褪黑素含量的主要方法。【本研究切入點】褐飛虱褪黑素的含量和作用機理尚待深入研究。【擬解決的關鍵問題】本研究通過高效液相色譜-串聯質譜技術對1～5 齡若蟲和長短翅、雌雄成蟲的褪黑素含量進行測定和比較，明確褪黑素在褐飛虱各發育階段的含量情況，為后續褪黑素作用機理研究提供方向和數據支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：TG-16G 臺式高速離心機（湖南凱達科學儀器有限公司），FA1204 電子天平（精確度0.1 mg，上海衡際科學儀器有限公司），AGLIENT1290高效液相色譜儀（美國AGLIENT 公司），SCIEX-6500Qtrap 質譜儀（MS/MS）（美國AB 公司），CHA-2氣浴恒溫搖床（蘇州威爾實驗用品公司），PS40A超聲清洗儀（深華泰科學儀器有限公司），水浴氮吹儀（上海那艾儀器有限公司）。

試劑：褪黑素（melatonin）標準品（美國Sigma公司），甲醇、乙腈（色譜級，德國默克醫藥生物科技公司）。

1.2 標曲溶液配制

取1 mg 褪黑素標準品粉末，置于2 mL 甲醇中，震蕩溶解均勻，作為褪黑素標準品儲備液。取甲醇998 μL 于1.5 mL 離心管，加入500 μg·mL-1褪黑素標準品儲備液2 μL，震蕩均勻，配制1 μg·mL-1的工作母液；母液繼續用甲醇稀釋至20.00、5.00、2.00、0.50、0.20、0.05 ng·mL-1系列標曲溶液。

1.3 褐飛虱飼養及樣品收集

供試褐飛虱種源于2017 年夏季取自從福建省農業科學院水稻研究所試驗田，用臺中1 號（TN1）品種水稻苗在室內飼養，飼養條件為：每日5:00～18:59光照，光照周期14L∶10D；室內溫度（28±1 ）℃，相對濕度60%～70%。

收集同一批次羽化褐飛虱雌雄成蟲各約50 頭放入一個新養蟲籠內。籠內提供足量TN1 水稻新苗供雌蟲產卵。待卵孵化后，根據發育進程，并參照丁錦華等[18]對褐飛虱若蟲齡期的鑒別方法，依次收集1～2 齡若蟲、3 齡若蟲、4 齡若蟲、5 齡若蟲、長翅雌性成蟲、長翅雄性成蟲、短翅雌性成蟲和短翅雄性成蟲共8 個蟲態褐飛虱，每個蟲態取3 份樣，每份樣品重量不低于100 mg，收集時間段均在14:00～15:00。蟲樣裝于1.5 mL 離心管后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.4 樣品前處理

稱取0.02 g 樣品，加入約10 倍體積二氯甲烷，用一次性研磨棒研磨后在4 ℃下浸泡過夜，12 000 g、4 ℃離心5 min，取下層二氯甲烷相；上層物質取出后加入二氯甲烷再度浸泡過夜，離心取二氯甲烷相，合并兩次提取的二氯甲烷相，氮氣吹至近干，200 μL 甲醇復溶后過0.22 μm 有機相濾膜，定容至200 μL，-20 ℃保存待測。

1.5 HPLC-MS/MS 檢測條件

液相條件：色譜柱為poroshell 120 SB-C18 反相色譜柱（2.1×150，2.7 μm）；柱溫30 ℃。

流動相：A:B=（甲醇/0.1% 甲酸）:（水/0.1%甲酸）；洗脫梯度:0～1.0 min，50%；1.0～3.0 min，50%～80%；3.0～3.1 min，80%～50%；3.1～6.0 min，50%。流速300 μL·min-1；進樣量2 μL；分析時間6 min。

質譜條件：電離方式采用ESI 正負離子模式分別監測；掃描類型MRM；氣簾氣25 psi；

噴霧電壓：+3 500 V；霧化氣壓力55 psi；輔助氣壓力65 psi；霧化溫度450 ℃。

褪黑素反應監測條件見表1。褪黑素分子量為233，電噴霧電離正離子模式，質子化后母離子[M+H]+為233，選為定性離子。隨后碰撞過程中會丟失NH4CO2，形成主要碎片m/z174.1，選為定性離子。褪黑素出峰保留時間為3.38 min。

表1 褪黑素質子化或去質子化的選擇反應監測條件（[M+H]+或[M-H]-）Table 1 Conditions for monitoring protonated [M+H]+ or deprotonated [M-H]- melatonin reactions

1.6 數據分析

儀器所測得含量為最終提取液的含量，經計算獲得原樣品中激素含量，計算方法如下：

樣品中褪黑素含量（ng·g-1）=[ 檢測含量（ng·mL-1）×稀釋體積（mL）]/稱取質量（g）

式中：稀釋體積為樣品最終溶解進樣時所用的溶液體積；稱取質量為提取時的取樣質量；檢測含量由待測物質峰面積代入標曲方程計算求得。

試驗數據重復測定3 次，取平均值。應用SPSS 22.0、Microsoft Excel 2010 以 及OriginPro 8.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 褪黑素標準曲線

20.00、5.00、2.00、0.50、0.20、0.05 ng·mL-16 個標曲溶液以平均峰面積為縱坐標（y），褪黑素標準品含量為橫坐標（x），繪制標準曲線。得到線性回歸方程y=135 403x+10 164，R2=0.999，峰面積與含量呈現出良好的線性關系，可用于定量分析（圖1）。

圖1 褪黑素標準曲線Fig.1 Standard curve of melatonin

2.2 各齡期褐飛虱若蟲褪黑素含量比較

如圖2 所示，在若蟲階段，1～2 齡褐飛虱若蟲的褪黑素含量均值最低，為378.5 pg·g-1，進入3 齡后褪黑素含量快速上升并達到若蟲階段的峰值（均值856.6 pg·g-1），4 齡、5 齡時褪黑素含量逐漸下降，均值分別為810.7 pg·g-1和574.5 pg·g-1，但5 齡若蟲褪黑素含量仍顯著高于1～2 齡。3 齡和4 齡若蟲間褪黑素含量無顯著差異，但顯著高于1～2 齡和5 齡時期若蟲褪黑素含量（圖2）。

2.3 各齡期褐飛虱若蟲褪黑素含量比較

若蟲羽化為成蟲后，雌、雄褐飛虱的褪黑素含量出現極端分化（圖3）：以性別（雌、雄）和翅型（長翅、短翅）為變量，對成蟲階段褪黑素含量進行雙因素方差分析（Two-way ANOVA）。結果表明，褐飛虱成蟲雌雄間褪黑素含量差異顯著（df=1,8；F=630.083；P＜0.001），而長、短翅型間的差異不明顯（df=1,8；F=1.854；P=0.210）。性別和翅型間的交互效應不顯著（df=1,8；F=2.630；P=0.144）。長、短翅雄性成蟲褪黑素含量上升明顯，均值分別為978.3 pg·g-1和969.6 pg·g-1，高于若蟲階段褪黑素峰值（3 齡若蟲）；長、短翅雌性成蟲褪黑素含量則急劇下降，均值分別為76.1 pg·g-1和176.8 pg·g-1，不足雄性成蟲的四分之一。單因素方差分析及LSD多重比較結果表明，雄性長、短翅成蟲褪黑素含量無顯著差異，與雌性兩個翅型成蟲相比差異極顯著（P＜0.01）（圖3）。

圖3 褐飛虱成蟲褪黑素含量比較Fig.3 Melatonin contents of adult N.lugens

3 討論與結論

本研究結果表明，褐飛虱整個生長發育期體內褪黑素含量范圍在76.1～978.3 pg·g-1，若蟲體內褪黑素含量的峰值為856.6 pg·g-1，出現在3 齡后，隨后逐漸下降，羽化后的成蟲體內褪黑素含量受性別影響極端分化，雄蟲體內所含褪黑素約是雌蟲的5～12倍，分別為長翅雌蟲76.1 pg·g-1、長翅雄蟲978.3 pg·g-1、短翅雌蟲176.8 pg·g-1、短翅雄蟲969.6 pg·g-1，這表明褐飛虱體內的褪黑素含量具有顯著的性別間差異。前人發現昆蟲體內的褪黑素主要集中在頭部[6,12]，且相較植物中的褪黑素含量，昆蟲體內的褪黑素含量極少，更加難以檢測。褐飛虱一二齡若蟲個體微小，若僅針對其頭部進行褪黑素測定，難度和誤差均較大，因而本試驗整體進行褪黑素的提取。

褐飛虱為半變態昆蟲，若蟲具有5 個齡期，從若蟲到成蟲共經歷5 次蛻皮，而蛻皮激素是控制其蛻皮的關鍵因素[18]。已有的研究證實，褪黑素可促進美洲大蠊Periplaneta americana（L.）促前胸腺激素分泌，進而刺激蛻皮激素合成[11]。在本研究中，3～5 齡褐飛虱若蟲保持相對較高的褪黑素含量，這對蛻皮激素的合成有利。本研究另一個重要的發現是褐飛虱雌雄成蟲間褪黑素的含量存在極顯著差異。在對蟋蟀Acheta domesticus的研究中發現，褪黑素可以調控其移動行為規律[19]。褐飛虱的求偶交配過程遵循“call-fly”策略，即雄性成蟲表現活躍，四處搜尋并發出振動信號通過寄主進行傳遞，雌性接收信號后靜止不動并以特有振動信號進行回復，收到反饋的雄性對雌性進行定位并移動接近[20]。在前期的研究中也發現雄性褐飛虱的移動量顯著高于雌性[21]，推測褪黑素對褐飛虱成蟲的移動行為起調控作用。另有研究指出，褪黑素對卵巢發育具有抑制作用[22]，因此褐飛虱雌性成蟲褪黑素含量低也有利于卵巢發育。后續我們將開展褪黑素對褐飛虱移動行為和卵巢發育的調控研究。