新型鵝星狀病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用

余明興，林裕勝

（1.福建省浦城縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，福建 浦城 353400；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013）

0 引言

【研究意義】2017 年以來，我國(guó)江蘇、河南、河北、廣東、福建、安徽、浙江等多省養(yǎng)鵝場(chǎng)暴發(fā)了由新型鵝星狀病毒引起的雛鵝痛風(fēng)病。該病主要發(fā)生于5～20 日齡雛鵝，臨床癥狀主要表現(xiàn)為站立不穩(wěn)、消瘦、精神沉郁、采食量下降，剖檢可見腎臟、肝臟及關(guān)節(jié)處有尿酸鹽沉積，其發(fā)病率在30%左右，死亡率最高可達(dá)50%[1-3]，給我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。福建省是鵝星狀病毒病的首發(fā)疫區(qū)之一。鑒于目前市面上尚無可預(yù)防或治療該病的相關(guān)疫苗或藥物，使得該病的防控異常困難。因此，建立一種快速檢測(cè)新型鵝星狀病毒的檢測(cè)方法對(duì)于該病早期診斷顯得尤為重要。【前人研究進(jìn)展】鵝星狀病毒屬于星狀病毒科（Astroviridae）禽星狀病毒屬（Avastrovirus），經(jīng)基因組解析后發(fā)現(xiàn)與火雞星狀病毒和鴨星狀病毒有明顯不同，屬于新的基因型，因此當(dāng)前命名為新型鵝星狀病毒[4-5]。目前新型鵝星狀病毒的診斷方法主要有分離鑒定法、電鏡觀察法、常規(guī)PCR 法、LAMP 法和熒光定量PCR 法[6]。分離鑒定法主要通過接種鵝胚或鵝胚腎細(xì)胞，一般需要傳至3 代左右才可出現(xiàn)鵝胚死亡或出現(xiàn)明顯病變，比較耗費(fèi)時(shí)間。電鏡觀察法是星狀病毒早期的檢測(cè)方法之一，然而Yuan等[7]使用鵝肝臟超薄切片進(jìn)行觀察，卻無法觀察到星狀病毒特有的形態(tài)，因此該方法存在一定的缺陷。在分子診斷技術(shù)方面，前人也進(jìn)行了相關(guān)研究，如張玉霞等[8]基于ORF1b基因建立的LAMP 檢測(cè)方法，邱思語(yǔ)等[9]基于ORF1b建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法，白彩霞等[10]基于ORF2 建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR方法，Yuan 等[11]基于ORF1b建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法。分子生物學(xué)方法是目前病原檢測(cè)應(yīng)用最廣泛的一種方法，尤其是PCR 技術(shù)，因能檢測(cè)到微量的病原DNA 而常應(yīng)用于病原體的早期檢測(cè)，與分離培養(yǎng)法、電鏡分離法、ELISA 法和免疫熒光檢測(cè)法等相比具有一定優(yōu)勢(shì)[12]。姜?jiǎng)倌械萚13]、蒲路莎等[14]研究表明當(dāng)前流行的新型鵝星狀病毒毒株之間ORF2 核苷酸編碼的氨基酸同源性高達(dá)99.4%以上，保守性較高，適合作為病原診斷靶基因。【本研究切入點(diǎn)】為進(jìn)一步擴(kuò)展新型鵝星狀病毒的檢測(cè)方法，本研究根據(jù)新型鵝星狀病毒ORF2基因?yàn)榘谢蚪⑿滦往Z星狀病毒 RTPCR 檢測(cè)方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究利用Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)并篩選出1 對(duì)特異性引物，建立適用于檢測(cè)新型鵝星狀病毒的RT-PCR 方法，為新型鵝星狀病毒病臨床樣品的快速檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株及臨床樣品 新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、禽呼腸孤病毒（Avian reovirus,ARV）、鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus,GPV）、鵝多瘤病毒（Goose hemorrhagic polyomavirus,GHPV）、鵝圓環(huán)病毒（Goose vircovirus,GoCV）和新型鵝星狀病毒等DNA 或cDNA 由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物病毒研究室提供。45 份臨床樣品于2019–2020 年期間采自福建省浦城縣，均為臨床上疑似鵝痛風(fēng)的脾、腎組織和關(guān)節(jié)液，發(fā)病鵝表現(xiàn)為關(guān)節(jié)腫大，剖檢腎臟表面可見大量尿酸鹽沉積。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA/DNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Ex TaqDNA 聚合酶、DL2000、DL1000 Marker 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)GenBank 登錄的新型鵝星狀病毒SDXT 株（No.MN399857）ORF2 基因序列，利用Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)并篩選出1 對(duì)特異性引物，引物的核苷酸序列為：P1:5′-ATGAAGGCCGAGAG GAAGCTT -3′；P2：5′-GTTCAAGATGCGGCCGA GC -3′。擴(kuò)增片段大小為384 bp。引物由福州博尚生物有限公司合成。

1.2.2 核酸抽提 利用病毒DNA/RNA 提取試劑盒、參照說明書分別提取供試病毒和臨床樣品的DNA 和RNA，用作PCR 反應(yīng)的模板。

1.2.3 反應(yīng)條件及優(yōu)化 cDNA 合成按照全式金生物技術(shù)有限公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 終止反應(yīng)。PCR 擴(kuò)增采用 25 μL 體系，Premix 12.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 2 μL，上下游引物濃度采用矩陣法在0.4～1.2 μmol·L-1調(diào)整，無菌去酶水補(bǔ)足20 μL。PCR 反應(yīng)程序：擴(kuò)增條件為 95 ℃ 5 min 熱啟動(dòng)，94 ℃變性15 s，退火溫度在50 ℃～60 ℃調(diào)整 15 s，72 ℃延伸15 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 延伸 7 min。待反應(yīng)結(jié)束后取 PCR 產(chǎn)物 7 μL，1.5%瓊脂凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)掃描儀下觀察拍照。擴(kuò)增的特異性片段割膠回收后純化，再送測(cè)序公司測(cè)序，通過Blast比對(duì)驗(yàn)證擴(kuò)增片段的正確性。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用建立的 RT--PCR 方法擴(kuò)增新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒，檢驗(yàn)建立方法的特異性效果。

1.2.5 敏感性試驗(yàn) 將反轉(zhuǎn)錄得到的新型鵝星狀病毒cDNA（原液濃度為62 ng·μL-1）進(jìn)行10 倍遞增稀釋，共稀釋成9 個(gè)濃度梯度，分別為6.2 ng·μL-1、620 pg·μL-1、62 pg·μL-1、6.2 pg·μL-1、620 fg·μL-1、62 fg·μL-1、6.2 fg·μL-1、620 ag·μL-1、62 ag·μL-1，利用優(yōu)化好的方法進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)該方法的敏感性。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 利用建立的新型鵝星狀病毒RTPCR 方法對(duì)3 份新型鵝星狀病毒分離株cDNA 進(jìn)行 3次 RT--PCR 擴(kuò)增。進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，每次樣品均設(shè)3 個(gè)重復(fù)；進(jìn)行批間重復(fù)試驗(yàn)時(shí)，3 份新型鵝星狀病毒cDNA 樣品間隔5 d 檢測(cè)1 次，共檢測(cè)3 次。

1.2.7 RT-PCR 方法初步應(yīng)用 利用建立的RT-PCR方法對(duì)從浦城采集的45 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置新城疫病毒和鵝細(xì)小病毒做陰性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化及擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定

RT-PCR 最佳反應(yīng)體系為：Premix 10 μL，ORF2上下游引物濃度10 μmol·L-1各1 μL，模板3 μL，無菌去離子水補(bǔ)足至20 μL。最佳反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃2 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、72 ℃ 15 s，30 個(gè) 循環(huán)；72 ℃ 10 min。應(yīng)用優(yōu)化后的體系對(duì)新型鵝星狀病毒進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，新型鵝星狀病毒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增出1 條約380 bp 的目的片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。測(cè)序結(jié)果顯示，RT-PCR 擴(kuò)增的新型鵝星狀病毒ORFV基因序列長(zhǎng)度為384 bp，與參考的MN399857 株序列同源性為99.8%，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 新型鵝星狀病毒ORF2 基因的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification on ORF2 of NGAstV by RT-PCR

2.2 特異性擴(kuò)增

利用建立的RT-PCR 檢測(cè)方法對(duì)新型鵝星狀病毒、新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒的核酸進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。結(jié)果顯示，僅新型鵝星狀病毒擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的目的條帶，而新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒和去離子水樣品均為陰性（圖2），表明建立的RTPCR 方法具有良好的特異性。

圖2 新型鵝星狀病毒RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity of NGAstV detection by RT-PCR

2.3 敏感性試驗(yàn)

新型鵝星狀病毒核酸反轉(zhuǎn)錄后的cDNA 濃度為62 ng·μL-1，以10倍系列稀釋成6.2 ng·μL-1、620 pg·μL-1、62 pg·μL-1、6.2 pg·μL-1、620 fg·μL-1、62 fg·μL-1、6.2 fg·μL-1、620 ag·μL-1、62 ag·μL-1進(jìn)行PCR敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示：建立的新型鵝星狀病毒RTPCR 方法的檢測(cè)限均為62 fg·μL-1（圖3）。

圖3 RT-PCR 敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity of RT-PCR assay

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

利用建立的新型鵝星狀病毒RT-PCR 方法對(duì)3 份新型鵝星狀病毒陽(yáng)性樣品，新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、鵝細(xì)小病毒、鵝多瘤病毒、鵝圓環(huán)病毒各1 份作陰性對(duì)照進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果顯示，批內(nèi)和批間試驗(yàn)結(jié)果均一致（圖略），即除了3 份新型鵝星狀病毒陽(yáng)性樣品有擴(kuò)增條帶，其余樣品均無擴(kuò)增條帶，表明重復(fù)性好。

2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用建立的RT-PCR 方法對(duì)45 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，45 份樣品中新型鵝星狀病毒共檢測(cè)出15 份，陽(yáng)性率為33.33%（15/45），表明該病在浦城縣流行較為嚴(yán)重，應(yīng)引起重視，圖4 為部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果。

圖4 部分臨床樣品RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection of NGAstV on clinical samples by RT-PCR assay

3 討論與結(jié)論

星狀病毒在我國(guó)水禽群體中分布地域廣泛且宿主范圍寬廣，能夠引起雞的腎炎、鴨的病毒性肝炎、火雞腸炎等。鵝的星狀病毒病是近年來通過多位學(xué)者[15-16]研究才確認(rèn)的，然而目前對(duì)該病的致病機(jī)理尚不明確，缺乏有效的商品化疫苗，導(dǎo)致該病給養(yǎng)鵝業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。福建省南平市是養(yǎng)鵝大市，因該病給養(yǎng)鵝戶造成的經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重。為了更好地對(duì)福建省新型鵝星狀病毒病有更好的了解，為養(yǎng)殖戶提供更為快速便捷的檢測(cè)結(jié)果，建立一種用于檢測(cè)新型鵝星狀病毒的RT-PCR 方法顯得尤為重要。

隨著規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的不斷發(fā)展，當(dāng)前多種疫病臨床癥狀十分接近，剖解病變相差無幾，不利于精準(zhǔn)確定病因，耽誤最佳治療時(shí)間。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)已然成為輔助臨床診斷的主要方法。PCR 技術(shù)是目前所有動(dòng)物疫病中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，與熒光定量PCR 技術(shù)相比，不需要昂貴的儀器設(shè)備，而且操作流程簡(jiǎn)單，適合于基層工作者使用。

目前建立鵝星狀病毒的分子診斷技術(shù)有張玉霞等[8]基于ORF1b基因建立的LAMP 檢測(cè)方法，其靈敏度為1 ng·μL-1；邱思語(yǔ)等[9]基于ORF1b建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為24.2 拷貝·μL-1，白彩霞等[10]基于ORF2 基于建立的SYBR Green I 熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為3.75 拷貝·μL-1，Yuan 等[11]基于ORF1b建立的TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 方法，其靈敏度為52.5 拷貝·μL-1。本研究根據(jù)新型鵝星狀病毒ORF2 基因設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性的引物，通過對(duì)引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，建立了新型鵝星狀病毒RT-PCR 檢測(cè)方法，其靈敏度為62 fg·μL-1，與邱思語(yǔ)等[9]、白彩霞等[10]、Yuan 等[11]建立熒光定量PCR 方法相比其靈敏性相距較遠(yuǎn)，但與張玉霞等[8]建立的LAMP 方法相比，本研究建立的方法靈敏度高100 倍。此外，本研究建立的方法對(duì)鵝常見病毒均未有檢測(cè)出，表明特異性強(qiáng)；通過批內(nèi)、批間重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果表明，該方法具有良好的穩(wěn)定性。通過對(duì)45 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示15 份樣品陽(yáng)性，陽(yáng)性率為33.33%，提示新型鵝星狀病毒病應(yīng)當(dāng)引起當(dāng)?shù)赜嘘P(guān)部門重視。

本研究成功建立了新型鵝星狀病毒RT-PCR 檢測(cè)方法，其特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)，為及時(shí)控制該病提供有效的方法。