孟魯司特預處理對阿司匹林誘導的胃黏膜上皮細胞損傷的影響及其可能機制▲

黃 嬌 羅杰偉 韓 麗 楊 莉 魏 瑩

(1 川北醫學院附屬醫院藥劑科，四川省南充市 637000，電子郵箱：jxkcg73@163.com；川北醫學院2 基礎醫學院，3 藥學院，四川省南充市 637800)

非甾體抗炎藥具有廣泛的鎮痛、抗炎和解熱作用，是世界上使用最廣泛的藥物之一[1]。然而，阿司匹林等非甾體抗炎藥可引起各種胃腸道副作用，包括胃腸道潰瘍、出血和穿孔，而這些可能是致命性的[2]。因此，需要探索保護應用非甾體抗炎藥患者胃黏膜完整性的措施。研究表明，阿司匹林誘導人胃黏膜上皮細胞GES-1損傷的同時，可增加腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白細胞介素(interleukin，IL)-6的表達[3]。核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號通路參與阿司匹林誘導的胃黏膜上皮細胞GES-1損傷過程[3]。而孟魯司特可以抑制炎癥因子IL-1β誘導的黏連蛋白表達[4]，并可抑制NF-κB信號通路的激活[5]。然而，孟魯司特是否可以減輕阿司匹林誘導的胃黏膜上皮細胞GES-1損傷，目前尚未可知。因此，本研究以胃黏膜上皮細胞GES-1為對象，利用阿司匹林誘導GES-1細胞損傷，觀察孟魯司特預處理對細胞增殖、凋亡的影響，并探索其潛在的作用機制，從而為防治胃黏膜損傷的深入研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 胃黏膜上皮細胞GES-1購自美國典型培養物保藏中心。阿司匹林(含量≥99%，貨號：A2093)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT；貨號：M2128)、NF-κB信號通路激活劑脂多糖(貨號：L2630)購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒(貨號：D203-01)購自中國GenStar BioSolutions公司；異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ(annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate，Annexin Ⅴ-FITC)/碘化丙啶細胞凋亡檢測試劑盒(貨號：KGA108)、細胞周期檢測試劑盒(貨號：KGA511)購自江蘇凱基生物公司；細胞周期蛋白D1(CyclinD1；貨號：2978)、細胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2；貨號：2546)、B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2；貨號：4223)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax；貨號：5023)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，Cleaved-Caspase-3；貨號：9664)、細胞核因子κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor κBα，IκBα；貨號：4812)、磷酸化IκBα(phosphorylated IκBα，p-IκBα；貨號：2859)、p65(貨號：8242)、磷酸化p65(phosphorylated p65，p-p65；貨號：3033)蛋白抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；TNF-α、IL-6酶聯免疫吸附檢測(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號分別為：E-EL-H0109c、E-EL-H0102c)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛檢測試劑盒(貨號分別為：C0016、S0109、S0131)購自碧云天生物技術公司；反轉錄試劑盒(貨號：RR036A)、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(貨號：RR820A)購自日本TaKaRa公司。二甲基亞砜購自上海梵態生物(貨號：FT20937yy)；RIPA裂解液購自北京索萊寶公司(貨號：R0015)。

1.2 GES-1細胞培養與分組 將GES-1細胞加入含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培養基中，置于37℃、5% CO2的培養箱中常規培養。將生長狀態良好的GES-1細胞(1×105個/孔)接種于96孔板，每孔100 μL。將藥物用培養基稀釋成所需濃度。GES-1細胞分為7組：(1)空白組，為正常培養的GES-1細胞；(2)阿司匹林組，使用18.5 mmoL/L阿司匹林100 μL處理GES-1細胞24 h[6]；(3)孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組，分別使用10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L孟魯司特[7]預處理GES-1細胞2 h后，使用18.5 mmoL/L阿司匹林處理24 h，給藥總量為100 μL；(4)孟魯司特+阿司匹林組，使用40 μmol/L孟魯司特預處理GES-1細胞2 h，使用18.5 mmoL/L阿司匹林處理24 h，給藥總量為100 μL；(5)孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組，使用40 μmol/L孟魯司特預處理GES-1細胞2 h后，然后使用18.5 mmoL/L阿司匹林、2.5μmoL/L 脂多糖同時處理24 h，給藥總量為100 μL。處理后，收集細胞進行后續實驗。

1.3 MTT法檢測GES-1細胞增殖 按1×105個/mL密度將各組GES-1細胞接種于96孔板中，用DMEM培養基培養于37℃、5% CO2的培養箱中培養48 h后，每孔細胞加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，37℃培養4 h，加入二甲基亞砜150 μL，37℃搖床振蕩培養10 min，采用美國BioTek公司EXL800酶標儀測定GES-1細胞在490 nm處的吸光度值。細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。

1.4 流式細胞術檢測GES-1細胞凋亡率和細胞周期 用磷酸鹽緩沖溶液重懸細胞，將各組GES-1細胞密度調整為1×106個/mL，參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書的步驟，使用500 μL緩沖液懸浮細胞，加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，加入碘化丙啶5 μL混勻，室溫遮光反應15 min，置于美國BD公司FACSCalibur流式細胞儀中檢測GES-1細胞凋亡率。根據細胞周期檢測試劑盒說明書的步驟，將各組GES-1細胞密度調整為1×106/mL，取1 mL細胞懸液進行細胞周期檢測。實驗重復9次。

1.5 檢測氧化應激指標LDH、SOD和丙二醛 收集各組GES-1細胞上清液，分別按照說明書的步驟進行LDH、SOD和丙二醛水平檢測。

1.6 ELISA法檢測炎癥因子TNF-α和IL-6水平 收集各組GES-1細胞上清，按照ELISA試劑盒說明檢測TNF-α和IL-6水平。

1.7 定量PCR檢測CyclinD1 mRNA和CDK2 mRNA表達 按照RNA提取試劑盒說明書的步驟提取各組細胞的總RNA。反轉錄體系共20 μL，參考反轉錄試劑盒說明書，將反應條件設置為42℃ 30～50 min(反轉錄反應)和85℃ 5 s(反轉錄酶失活反應)，得到模板cDNA。定量PCR反應體系共50 μL，包括25 μL SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2×)、2 μL PCR上游引物、2 μL PCR下游引物、1 μL ROX 參比染料(50×)、4 μL cDNA和16 μL雙蒸水。反應條件為95℃預變性10 min，95℃變性15 s，40個循環，60℃退火延伸1 min。ABI 7300熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。以β肌動蛋白(β-actin)作為內參。采用 2-ΔΔCt法計算CyclinD1 mRNA和CDK2 mRNA的相對表達量。引物由上海生工公司設計合成，序列如下：CyclinD1上游引物為 5′-GCATCTACACCGACAACTCCAT-3′，下游引物為5′-GTTTGTTCTCCTCCGCCTCT-3′；CDK2上游引物為5′-AATAGGCTGGGAGACTGAAGACT-3′，下游引物為5′-ATCCTTGGCAACTGAACAACTAA-3′；β-actin 上游引物為5′-TCATGAAGTGTGACGTGGACAT-3′，下游引物為5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。實驗重復9次。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測CyclinD1、CDK2、Bax、Bcl-2、Cleaved-Caspase-3、p-IκBα、IκBα、p-p65、p65蛋白表達 使用RIPA裂解液提取各組GES-1細胞的總蛋白，行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入目的蛋白一抗(均為1 ∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，次日用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜(10 min/次，共3次)，加入二抗(1 ∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜(10 min/次，共3次)，顯色、曝光，以β-actin作為內參蛋白，分析目的蛋白的表達量。實驗重復9次。

2 結 果

2.1 孟魯司特預處理對阿司匹林誘導的GES-1細胞增殖抑制及細胞周期變化的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細胞增殖抑制率、G0/G1期細胞比例升高，S期細胞比例下降，CyclinD1和CDK2的mRNA和蛋白表達量降低(均P<0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組GES-1細胞增殖抑制率、G0/G1期細胞比例依次下降，S期細胞比例依次升高，CyclinD1和CDK2的mRNA和蛋白表達量依次升高(均P<0.05)。見表1、表2和圖1。

表1 5組GES-1細胞周期和細胞增殖抑制率的比較 (±s，%)

表2 5組細胞CyclinD1和CDK2 mRNA和蛋白相對表達量的比較 (±s)

圖1 5組GES-1細胞中CyclinD1和CDK2蛋白表達

2.2 孟魯司特預處理對阿司匹林誘導的GES-1細胞凋亡的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細胞凋亡率以及Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量升高，Bcl-2蛋白相對表達量降低(均P<0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組的GES-1細胞凋亡率以及Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量依次降低，而Bcl-2蛋白相對表達量依次升高(均P<0.05)。見表3、圖2。

表3 5組GES-1細胞凋亡率及凋亡相關蛋白相對表達量的比較(±s)

圖2 5組GES-1細胞凋亡情況及凋亡相關蛋白表達情況

2.3 孟魯司特預處理對阿司匹林誘導的GES-1細胞中氧化應激指標和炎癥因子表達的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細胞中LDH、丙二醛、TNF-α、IL-6水平升高，SOD活性降低(均P<0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組GES-1細胞的LDH、丙二醛、TNF-α、IL-6水平依次降低，SOD活性依次升高(均P<0.05)。見表4。

表4 5組GES-1細胞中LDH、SOD和MDA水平的比較(±s)

2.4 孟魯司特預處理對阿司匹林誘導的GES-1細胞中NF-κB信號通路的影響 與空白組比較，阿司匹林組的GES-1細胞中p-IκBα、p-p65蛋白相對表達量均增加(P<0.05)，但IκBα、p65蛋白相對表達量差異均無統計學意義(均P>0.05)。阿司匹林組、孟魯司特低濃度組、孟魯司特中濃度組、孟魯司特高濃度組GES-1細胞中p-IκBα、p-p65蛋白相對表達量均依次下降(均P<0.05)，但各組間IκBα、p65蛋白相對表達量差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表5、圖3。

表5 5組細胞GES-1中p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白相對表達量的比較(±s)

圖3 蛋白免疫印跡法檢測胃黏膜上皮細胞GES-1中p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白表達

2.5 NF-κB信號通路激活劑逆轉孟魯司特對GES-1細胞的保護作用 (1)細胞增殖方面：與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組GES-1細胞增殖抑制率、G0/G1期細胞比例增高，而S期細胞比例、CyclinD1、CDK2蛋白相對表達量降低(均P<0.05)。(2)細胞凋亡方面：與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組細胞凋亡率、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白相對表達量增加，而Bcl-2蛋白相對表達量降低(均P<0.05)。見表6、表7、圖4。

表6 兩組GES-1細胞增殖抑制率、細胞周期及相關蛋白相對表達量的比較(±s)

表7 兩組GES-1細胞凋亡率及凋亡相關蛋白相對表達量的比較(±s)

圖4 兩組GES-1細胞凋亡率、細胞周期和細胞凋亡相關蛋白表達情況

2.6 脂多糖部分逆轉孟魯司特對人胃黏膜上皮細胞GES-1中炎癥反應和NF-κB信號通路的作用 與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組GES-1細胞上清液的TNF-α、IL-6水平以及p-IκBα、p-p65蛋白相對表達量均升高(均P<0.05)，但IκBα、p65蛋白相對表達量差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表8、圖5。

表8 兩組GES-1細胞的炎癥因子水平和NF-κB信號通路相關蛋白相對表達量的比較 (±s)

圖5 蛋白免疫印跡法檢測胃黏膜上皮細胞GES-1中p-IκBα、IκBα、p-p65和p65蛋白表達

3 討 論

非甾體消炎藥具有良好的解熱、鎮痛、抗炎、抗風濕等作用，在凝血、卒中和心肌缺血方面有良好的應用前景[8]。隨著疼痛、炎癥和心血管疾病發生率的增加，阿司匹林的消耗量將會更高[9]。因此，非甾體類藥物被廣泛應用于臨床中。然而，此類藥物的不恰當使用(如過量、長期或錯誤的配方)是造成胃損傷的主要原因，表現為胃黏膜侵蝕、出血，甚至潰瘍，限制了其臨床應用[8]。本研究利用阿司匹林誘導胃黏膜上皮細胞GES-1損傷，結果顯示，與空白組比較，阿司匹林組細胞增殖抑制率、G0/G1期細胞比例、細胞凋亡率、促凋亡因子Bax和Cleaved-Caspase-3的表達均增高，CyclinD1、CDK2和抗凋亡因子Bcl-2的表達均降低(均P<0.05)，這提示阿司匹林可抑制細胞增殖，阻滯細胞于G0/G1期，并誘導細胞凋亡。阿司匹林導致的胃黏膜損傷與炎癥、氧化損傷密切相關[10]。當阿司匹林損傷胃黏膜時，TNF-α和IL-6等炎性因子會大量產生[10]。LDH、SOD和丙二醛可作為評估氧化損傷的指標。本研究中，與空白組比較，阿司匹林組GES-1細胞上清液的LDH、丙二醛、TNF-α和IL-6水平均升高，而抗氧化酶SOD的活性降低(均P<0.05)，這提示阿司匹林通過炎癥反應和氧化損傷導致GES-1細胞損傷，與既往研究結果[10]相符。

孟魯司特是一種半胱氨酸白三烯受體拮抗劑，臨床常用來治療哮喘和過敏性鼻炎，也用于治療運動引起的支氣管痙攣或小兒過敏性紫癜[11-13]。既往研究表明，孟魯司特對呼吸道合胞病毒感染引起的人支氣管上皮細胞16HBEC的炎癥反應具有抑制作用，能明顯降低IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，并減少活性氧簇含量[7]。在大鼠關節炎模型中，孟魯司特可降低大鼠血液和關節組織氧化應激標志物(脂質過氧化、蛋白羰基和一氧化氮)水平，并顯著降低細胞炎性因子IL-1β等的水平[14]。此外，孟魯司特還可有效拮抗阿奇霉素所致的大鼠腎臟丙二醛含量升高和SOD活性降低，減輕其氧化損傷[15]。然而，孟魯司特對阿司匹林誘導的胃黏膜上皮細胞GES-1的作用尚不清楚。本研究中使用不同濃度的孟魯司特進行預處理，結果顯示，其可減輕阿司匹林誘導的GES-1細胞增殖抑制、細胞周期阻滯、細胞凋亡，下調促凋亡因子的表達以及LDH、丙二醛、炎癥因子水平，并上調細胞周期蛋白、抗凋亡因子的表達，提高抗氧化酶SOD的活性，且上述作用具有一定的濃度依賴性，說明孟魯司特對阿司匹林損傷的胃黏膜上皮細胞GES-1具有保護作用，減輕阿司匹林誘導的脂質過氧化及炎癥反應，這為胃黏膜損傷的臨床診治策略提供了新的參考。

NF-κB是介導細胞增殖分化、細胞炎癥、凋亡和免疫應答等作用的關鍵性轉錄因子[16]。研究顯示，NF-κB信號通路在胃黏膜損傷中發揮著重要作用[17-18]。在本研究中，阿司匹林可導致GES-1細胞中NF-κB信號通路相關蛋白p-IκBα、p-p65水平升高(P<0.05)，但對IκBα、p65蛋白表達無明顯影響(P>0.05)。而不同濃度孟魯司特可降低p-IκBα、p-p65蛋白的表達量(P<0.05)，但不影響IκBα、p65蛋白表達(P>0.05)，提示孟魯司特可以抑制NF-κB信號通路的激活。另外，我們應用NF-κB信號通路激活劑脂多糖進行干預，結果顯示，與孟魯司特+阿司匹林組比較，孟魯司特+阿司匹林+脂多糖組GES-1細胞增殖抑制率、細胞凋亡率及促凋亡相關因子表達均升高，出現S期細胞周期阻滯，炎癥因子及NF-κB信號通路相關蛋白的表達均上調，即NF-κB信號通路激活劑部分逆轉了孟魯司特對阿司匹林所致GES-1細胞損傷的預防和保護作用。這些結果表明調控NF-κB信號通路可能是孟魯司特保護阿司匹林損傷GES-1細胞的重要途徑之一。

綜上所述，采用孟魯司特預處理可減輕阿司匹林誘導的GES-1細胞損傷，其作用機制可能與減輕氧化損傷和炎癥反應、調控NF-κB信號通路有關。然而，本研究僅觀察了孟魯司特在體外保護胃黏膜上皮細胞損傷的效果，其在體內的功能和作用機制仍需進一步探索。