白藜蘆醇對烏頭堿誘發大鼠心律失常的預防作用及其可能機制▲

李志坤 王希柱 宋巧鳳

(河北省唐山市人民醫院心電圖室,唐山市 063000，電子郵箱：mia55462@163.com)

心律失常是臨床常見病和高發病，心肌缺血及缺血后再灌注等多種心臟疾病均可引起心律失常，主要表現為期前收縮、房顫、心動過速等[1]。心律失常可增加疾病治療難度，尤其是發生惡性心律失常的患者，心源性猝死風險明顯增加[2-3]。因此，尋找有效藥物對抗心律失常并探討其調控機制，對心律失常的防治有重要臨床意義。白藜蘆醇(resveratrol，Res)屬于多酚類化合物，廣泛存在于葡萄皮和花生中，具有抗炎、抗動脈粥樣硬化等多種生物學作用，臨床常用于防治血脂異常、冠心病等疾病[4-5]。Res在心血管疾病的防治中有潛在應用價值，但關于其對心律失常的防治作用鮮有研究報道。鑒于此，本研究通過建立烏頭堿誘發的心律失常大鼠模型，觀察Res對大鼠心律失常及心電圖的影響，并進一步探討其影響機制，為臨床防治心律失常提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：80只無特定病原體級雄性Wistar大鼠，7周齡，體質量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2016-0011。大鼠自由進食和飲水，飼養于(25±1)℃、60%相對濕度、12 h明暗交替環境。

1.1.2 主要試劑和儀器：烏頭堿、Res(美國Sigma公司)，沉默信息調節因子2相關酶1(silent information regulator 2 related enzyme 1，SIRT1)特異性抑制劑EX-527(英國Tocris Bioscience公司)，二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)，兔抗大鼠SIRT1、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)、磷酸化AMPK(phosphorylated AMPK,p-AMPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PGC-1α)、β-肌動蛋白(β-actin)一抗(美國Abcam公司，貨號ab8277、ab273598、ab32112、ab54481、ab8227)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(北京索萊寶科技有限公司，貨號SA134)。XD-7100型心電圖儀(上海醫用電子儀器廠)，CheniDoc XRS化學發光成像分析系統(Bio-Rad公司)。

1.2 分組及干預 按體重大小連續編號，采用隨機數字表法將80只大鼠分為模型組、模型+Res組、模型+Res+EX-527組、對照組，每組各20只。干預方法：(1)模型+Res組，按照100 mg/kg給予Res灌胃(Res溶于5%羧甲基纖維素鈉，Res的最終濃度為10 mg/mL)，1次/d，連續2周；末次灌胃30 min后，使用烏頭堿誘發心律失常。(2)模型+Res+EX-527組，按照100 mg/kg給予Res灌胃，30 min后給予EX-527 10 mg/kg體質量腹腔注射給藥，1次/d，連續2周；末次灌胃30 min后，使用烏頭堿誘發心律失常。(3)模型組：按照10 mL/kg給予5%羧甲基纖維素鈉灌胃，1次/d，連續2周；末次灌胃后，使用烏頭堿誘發心律失常。(4)對照組：按照10 mL/kg給予5%羧甲基纖維素鈉灌胃，1次/d，連續2周；末次灌胃后，按1 mL/kg體質量舌下靜脈注射生理鹽水。

1.3 烏頭堿誘發大鼠心律失常模型的建立及鑒定 腹腔注射1%戊巴比妥鈉(6 mL/kg)麻醉大鼠后，取仰臥位固定，連接心電圖儀，將針狀電極插入四肢末端及劍突皮下，麻醉后連續監測心電圖5 min，模型組、模型+Res組、模型+Res+EX-527組大鼠按1 mL/kg體質量舌下靜脈注射質量分數為0.002%的烏頭堿(對照組舌下注射等量生理鹽水)，4 min內標準Ⅱ導聯檢測心電圖出現室性心動過速、心室顫動等波形時，判定為模型制備成功。60只舌下注射烏頭堿的大鼠中，共死亡14只，予以剔除，最終模型組14只、模型+Res組17只、模型+Res+EX-527組15只進行后續實驗，對照組20只全部存活，進入后續實驗。

1.4 心電圖監測及心律失常評分 (1)心電圖監測：記錄發生心律失常的大鼠數量，心律失常開始時間(即舌下靜脈注射后至出現心律失常異常波形的時間)；記錄完成舌下注射烏頭堿后4 min內標準Ⅱ導聯檢測心電圖中的Q-T間期、P-R間期、QRS波群時間；記錄麻醉前、造模后即刻(完成舌下注射烏頭堿后)以及造模后15 min、30 min、60 min時各組大鼠心率。(2)心律失常評分[6]：根據舌下注射烏頭堿后4 min內標準Ⅱ導聯檢測的心電圖情況進行評分。0分為無心律失常；1分為室性心動過速或心室顫動等心律失常異常波持續時間短于10 s；2分為心律失常異常波持續時間11～30 s；3分為心律失常異常波持續時間31～90 s；4分為心律失常異常波持續時間91～180 s和可逆心室顫動波持續時間短于10 s；5分為心律失常異常波持續時間長于180 s和可逆心室顫動波持續時間長于10 s；6分為出現不可逆性心室顫動波。

1.5 組織取材及保存 造模60 min后，處死各組大鼠，剖開胸腔暴露心臟，各組采用隨機數字表法取7只，采用預冷生理鹽水灌注心臟，灌注液清亮后，用4%多聚甲醛繼續灌注，結束后立即取心臟組織，保存于4%多聚甲醛中備用。各組另取7只僅灌注生理鹽水，取心肌組織保存于-80℃備用。

1.6 心肌組織病理學觀察 取固定于4%多聚甲醛中的心肌組織，經脫水、透明后，常規石蠟包埋，制備厚度為5 μm的連續切片；切片經脫蠟、梯度乙醇水化后，進行常規蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，最后中性樹膠封片，于光學顯微鏡下觀察心肌組織病理學變化。

1.7 心肌組織中SIRT1、AMPK、p-AMPK、PGC1α蛋白的檢測 取保存于-80℃的心肌組織75 mg，加入液氮制成凍干粉，加入1 mL蛋白裂解液，4℃靜置孵育20 min，4℃預冷離心機12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液，采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量。取30 μg蛋白樣品與等量上樣緩沖液混勻，沸水浴變性8～10 min，12 000 r/min離心15 min(離心半徑12 cm)，取上清液，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠、5%濃縮膠)，濕轉法將分離蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，TBST洗膜后封閉液封閉2 h；加入稀釋一抗[SIRT1、AMPK、p-AMPK(1 ∶500)，PGC1α、β-actin(1 ∶1 000)]，4℃孵育過夜；TBST洗滌后加入稀釋二抗(1 ∶5 000)，常溫孵育2 h，暗室中曝光顯影。以目的條帶平均光密度值與β-actin光密度值的比值表示蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 3個模型組大鼠心律失常發生情況及心律失常評分的比較 與模型組比較，模型+Res組室性心動過速、心室顫動的發生率降低，室性心動過速、心室顫動開始時間延遲，心律失常評分降低(均P<0.05)；與模型+Res組比較，模型+Res+EX-527組室性心動過速、心室顫動開始時間提前，心律失常評分升高(均P<0.05)。見表1。

表1 心律失常發生率、開始時間及心律失常評分的比較

2.2 4組大鼠心電圖監測指標變化 與對照組比較，其他3組Q-T間期、P-R間期延長，QRS波群增寬(P<0.05)；與模型組比較，模型+Res組Q-T間期、P-R間期縮短，QRS波群縮窄(P<0.05)；與模型+Res組比較，模型+Res+EX-527組Q-T間期、P-R間期延長，QRS波群增寬(P<0.05)。見表2。

表2 4組大鼠心電圖監測指標的比較(±s，ms)

2.3 4組大鼠干預期間心率變化 4組間心率差異有統計學意義(F組間=11.200，P組間<0.001)，其中與對照組比較，其他3組造模后即刻、造模后15 min、30 min、60 min心率均升高(均P<0.05)；模型+Res組造模后15 min、30 min、60 min心率均低于模型組(均P<0.05)；模型+Res+EX-527組造模15 min、30 min、60 min心率均高于模型+Res組(均P<0.05)。心率有隨時間變化的趨勢(F時間=56.137，P時間<0.001)，其中模型組、模型+Res組、模型+Res+EX-527組造模各時間點心率均高于麻醉前的心率(均P<0.05)；隨造模時間的延長，模型+Res組心率逐漸降低(P<0.05)，而模型組、模型+Res+EX-527組無明顯變化(P>0.05)。組間與時間存在交互效應(F交互=40.216，P交互<0.001)。見表3。

表3 4組大鼠干預期間心率變化(±s，次/min)

2.4 4組大鼠心肌組織病理學改變 HE染色結果顯示，對照組心肌結構清晰，橫紋排列整齊，細胞核完整；模型組可見片狀心肌嗜伊紅染色增強，且呈波浪樣變，偶見間質出血；模型+Res組心肌呈波浪樣變，少量點狀心肌嗜伊紅染色增強；模型+Res+EX-527組心肌組織病變較模型+Res組加重。見圖1。

對照組 模型組 模型+Res組 模型+Res+EX-527組

2.5 4組大鼠心肌組織中SIRT1、AMPK、p-AMPK、PGC1α蛋白表達量的比較 4組AMPK蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，其他3組SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對表達量均降低(P<0.05)；與模型組比較，模型+Res組SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對表達量均升高(P<0.05)；與模型+Res組比較，模型+Res+EX-527組SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對表達量均降低(均P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 4組大鼠心肌組織各蛋白的表達情況

表4 4組大鼠SIRT1、AMPK、p-AMPK、PGC1α蛋白相對表達量的比較(±s)

3 討 論

心律失常發生機制十分復雜，多源于心臟自律異常或激動傳導障礙，可單獨發病也可伴發其他心血管疾病，該病患者心肌受損嚴重，且心源性猝死發生率明顯增高，生命健康受到嚴重影響[7]。目前，臨床尚缺乏有效的抗心律失常西藥，且西藥副作用多，臨床應用的局限性強[8]。研究顯示，室性心律失常發病機制與多種離子通道功能障礙有關，烏頭堿中毒引發的心律失常可促進心肌細胞鈉離子內流及膜去極化，同時可誘發多源性異位節律點，從而誘發心律失常的發生[9]。有關抗心律失常的研究表明，中藥具有改善多離子通道功能異常的作用[10]，故尋找有效中藥對抗心律失常有重要意義。

心電圖是臨床診斷心律失常的主要方法，本研究應用舌下注射烏頭堿法誘發大鼠心律失常，心電圖顯示模型組室性心動過速發生率為100%，心室顫動發生率高于90%，造模后心率明顯升高，Q-T間期、P-R間期延長，QRS波群增寬，造模60 min后HE染色提示片狀心肌嗜伊紅染色增強，且呈波浪樣變，偶見間質出血，說明成功建立心律失常大鼠模型。Res是從自然界植物中提取的天然活性成分，在自然界中分布廣泛，具有潛在藥用價值。近年有研究顯示，Res與心臟疾病、炎癥、糖脂代謝異常及腫瘤等多種疾病的防治均有密切聯系[11]。姜曉曉等[12]在研究Res對心肌梗死大鼠心臟神經重塑過程中發現，Res可有效預防室性心律失常及心源性猝死，與王光宇等[13]針對Res對心肌梗死后心律失常影響的研究結果相似。本研究應用Res干預后再采用烏頭堿誘發心律失常，結果顯示，與模型組比較，模型+Res組室性心動過速、心室顫動發生率降低，室性心動過速、心室顫動開始時間延遲，心律失常評分降低，造模15 min及以后心率降低，Q-T間期、P-R間期縮短，QRS波群縮窄，HE染色提示心肌組織病變減輕，這提示Res具有對抗烏頭堿誘發心律失常的作用。

SIRT1是在哺乳動物體內發現的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴的脫乙酰化酶，與細胞能量代謝、細胞衰老、基因轉錄等多種生物學過程關系緊密[14]。AMPK是細胞能量代謝的關鍵因子，可通過調控細胞凋亡、蛋白降解等過程維持細胞能量供需平衡。在能量限制或運動等應激狀態下，AMPK激活SIRT1，延長細胞衰老過程[15]。PGC1α是SIRT1去乙酰化底物，應激狀態下細胞的能量代謝異常可使SIRT1去乙酰化水平改變，從而導致PGC1α轉錄活性相應地發生改變[16]。Kim等[17]的研究顯示，斑馬魚SIRT1基因敲除后，由于缺乏完整能量代謝系統導致斑馬魚對環境適應能力降低，壽命縮短。Ma等[18]研究發現，SIRT1基因敲除的小鼠可表現出糖尿病性心肌病癥狀，機體線粒體能量代謝功能異常，應用Res可激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號通路，改善心肌損傷。上述研究均說明SIRT1-AMPK-PGC1α信號通路在心肌組織能量代謝途徑中發揮重要的調節作用，但目前尚無研究證實Res是否通過該信號通路發揮心律失常保護作用。本研究應用Res預防性干預后，SIRT1、p-AMPK、PGC1α蛋白相對表達量均升高，提示Res可激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號通路；進一步應用SIRT1特異性抑制劑干預后，SIRT1-AMPK-PGC1α信號通路相關蛋白表達下調，且大鼠心率、心電圖監測指標及心肌組織病變均較模型+Res組變差，說明Res可能通過激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號通路發揮對抗烏頭堿誘發的大鼠心律失常的作用。

綜上所述，Res可明顯對抗烏頭堿誘發的大鼠心律失常，其機制可能與激活SIRT1-AMPK-PGC1α信號通路有關。本研究的結果或可為Res相關藥物的研發和應用提供參考，同時為心律失常的臨床防治提供新的治療靶點。在下一步的研究中應深入探討Res對SIRT1-AMPK-PGC1α信號通路的直接調控機制及下游作用靶點，以提供更充分的證據支持本研究結論。