初發(fā)腦梗死患者血小板內(nèi)皮聚集受體1基因多態(tài)性與卒中后神經(jīng)功能缺損和認知功能障礙的關(guān)系▲

郭宏偉 劉迪龑 胡義奎 劉濤生 譚龍君 馮 瓊

(武漢市武昌醫(yī)院/武漢科技大學(xué)附屬武昌醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科二病區(qū)，湖北省武漢市 430063，電子郵箱：1127246605@qq.com)

卒中后認知功能障礙是指在卒中這一臨床事件后6個月內(nèi)出現(xiàn)達到認知障礙診斷標準的一系列綜合征，其危險因素包括高齡、受教育程度低、復(fù)發(fā)性卒中等[1]。近年來，血小板內(nèi)皮聚集受體1(platelet endothelial aggregation receptor 1，PEAR1)基因位點rs12041331純合突變被證實與卒中復(fù)發(fā)以及抗血小板藥物療效下降有關(guān)[2]。為了排除復(fù)發(fā)性卒中對卒中后神經(jīng)功能缺損和認知功能障礙的影響，本研究選取初發(fā)腦梗死患者為研究對象，分析其卒中后神經(jīng)功能缺損和認知功能障礙的發(fā)病與PEAR1基因位點rs12041331單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年1月至2020年1月在武漢市武昌醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診或住院治療的150例初發(fā)腦梗死患者為研究對象。所有患者均符合全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議制定的腦梗死診斷標準[3]，并在我院經(jīng)顱腦CT或MRI檢查確診為腦梗死，排除短暫性腦缺血發(fā)作或小卒中患者、嚴重精神障礙和嚴重器官功能衰竭患者。根據(jù)PEAR1基因位點rs12041331的不同分型，將患者分為野生型組(GG組，68例)、純合突變型組(AA組，48例)、雜合突變型組(GA組，34例)。所有研究對象均自愿參加本研究并簽署知情同意書。本研究獲得武漢市武昌醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理道德委員會批準。

1.2 觀察指標

1.2.1 一般臨床資料：收集患者一般信息和既往病例資料。測量所有患者的身高、體重，計算體質(zhì)指數(shù)。高血壓定義為收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg，或正在接受降壓治療。糖尿病定義為空腹血糖≥7.0 mmol/L，或OGTT后2 h血糖≥11.1 mmol/L，或正在接受降糖治療。吸煙定義為幾乎每日吸煙，平均每日吸煙1支以上，時間>1年。飲酒定義為幾乎每日飲酒，平均每日飲酒50 g以上，時間>1年。高齡定義為年齡>75歲。低教育程度定義為中學(xué)以下文化程度或未接受過任何教育。于患者入院后次日，采集清晨空腹靜脈血5 mL，采用日本東芝全自動生化檢測儀測定血脂四項水平。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損程度評價：入組時采用美國國立衛(wèi)生院卒中量表(National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS)評價患者神經(jīng)功能缺損程度[4]，評價內(nèi)容包括患者意識水平、面癱、上肢運動等方面，評分越高表示患者神經(jīng)功能缺損越嚴重。

1.2.3 認知功能評價：取入組時以及卒中后6個月內(nèi)每月1次的簡易精神狀態(tài)檢查量表(Mini-Mental State Examination，MMSE)評分[5]，其中最大分值作為統(tǒng)計值，以此評價患者的認知功能。目前MMSE是國內(nèi)外應(yīng)用最廣的認知篩查量表，評價內(nèi)容包括時間定向力、地點定向力、即刻記憶、注意力及計算力、延遲記憶、語言、視空間。量表共30項題目，每項回答正確得1分，回答錯誤或答不知道計為0分，量表總分范圍為0～30分，量表總分越高表示認知功能越好。

1.2.4 PEAR1基因位點rs12041331 SNP的檢測：入組后次日清晨抽取所有患者空腹外周靜脈血3 mL，-20℃保存于乙二胺四乙酸管中，按照DNA提取試劑盒(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)說明書提取DNA，保存于-20℃。采用PCR-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)及直接測序法檢測基因型。PCR體系包括基因組DNA 2 μL、上下游引物各 5 μL、2×Taq Mix 12.5 μL(北京艾德萊生物科技有限公司)，加超純水0.5 μL補至25 μL。PCR擴增條件為94℃ 3 min，94℃ 30 s，58.5℃和59.5℃各30 s，72℃ 30 s，重復(fù)30個循環(huán)，72℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。rs12041331擴增引物正向序列為5′-CACTAATCTTATCCCCATTTTCTAGGTG-3′，反向為5′-GCCCTCTCAGCCTCCGAGC-3′。內(nèi)切酶為Becl，酶切片段AA大小為178 bp、230 bp，酶切片段AG大小為408 bp、178 bp、230 bp，酶切片段GG大小為408 bp。取上述聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物2 μL，內(nèi)切酶1 μL，10×NEB緩沖液2 μL，滅菌離子雙蒸水5 μL，反應(yīng)總體積10 μL。37℃酶切至少1 h終止酶切反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠，GelRed染色，140 V電壓、300 mA電流穩(wěn)壓電泳40 min，凝膠系統(tǒng)成像，觀察結(jié)果并照相。樣本測序及PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2 結(jié) 果

AA組患者的高齡者比例、吸煙者比例高于GG組，LDL-C水平和NIHSS評分均高于GG組和GA組(均P<0.05)，而MMSE評分低于GG組和GA組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組患者臨床資料的比較

組別n吸煙[n(%)]飲酒[n(%)]總膽固醇(x±s,mmol/L)三酰甘油(x±s,mmol/L)LDL-C(x±s,mmol/L)HDL-C(x±s,mmol/L)MMSE評分(x±s,分)GG組6817(25.00)12(17.65)4.29±1.371.81±0.862.41±1.081.51±0.7225.21±3.89AA組4823(47.92)#9(18.75)4.41±1.521.89±0.902.96±1.16#?1.45±0.6720.12±3.12#?GA組349(26.47)7(20.59)4.37±1.411.84±0.882.45±1.121.46±0.7023.87±3.45 F/χ2值7.4860.1300.1050.1173.7950.12029.352P值0.0240.9370.9000.8900.0250.887<0.001

3 討 論

PEAR1是一種參與血小板活化和巨核細胞生成的Ⅰ型跨膜受體，在血小板和內(nèi)皮細胞上均有表達，參與多種血管性疾病和血栓形成[6]。PEAR1基因突變與血小板的激活和心血管不良結(jié)局有關(guān)[7]。研究表明，PEAR1是一種新的血小板受體，其磷酸化可促進αⅡbβ3信號的激活放大，使大量血小板脫顆粒，引起血小板之間不可逆的聚集反應(yīng)[8]。人體PEAR1基因定位于1q23.1，約30 kb，包括23個外顯子和22個內(nèi)含子，PEAR1多個位點的SNP與血小板功能及血管功能密切相關(guān)，PEAR1基因不同位點的變化可對血小板反應(yīng)性產(chǎn)生一定的影響[9]。

PEARl在血液循環(huán)中的血小板表面呈低水平表達，在二磷酸腺苷、交聯(lián)膠原蛋白相關(guān)肽CRP-XL及其他因素刺激下，PEAR1的表達上調(diào)，促使血小板膜糖蛋白Ⅱb與Ⅲa結(jié)合構(gòu)成纖維蛋白原受體，兩者再與纖維蛋白原結(jié)合，進而加速血栓形成[10]。研究表明，PEAR1基因能夠發(fā)揮激活血小板、降低巨核祖細胞的增殖、促進血小板的聚集反應(yīng)等作用，并與冠心病、腦卒中等心腦血管疾病密切相關(guān)[11]。國內(nèi)學(xué)者魯燕等[12]的研究表明，冠心病患者發(fā)生阿司匹林抵抗與PEAR1基因多態(tài)性密切相關(guān)，PEAR1基因型GG患者對阿司匹林的應(yīng)答性最好，而PEAR1基因型AA患者對阿司匹林存在嚴重抵抗。陳靜靜等[13]也發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因rs12041331位點A等位基因與缺血性腦卒中患者發(fā)生阿司匹林抵抗有關(guān)。

由于PEARl SNP與正常人血小板功能反應(yīng)有關(guān)，目前針對SNP研究的相關(guān)位點主要有rs12401331、rs9550270、 rs4661012、rs11264579、rs3737224、rs1273215、rs1256688等，其中關(guān)于rs12041331對血小板聚集功能的影響研究較多。Keramati等[14]發(fā)現(xiàn)，在通過測序鑒定出的PEAR1基因532個變體中，內(nèi)含子1變體rs12041331與所有血小板聚集表型顯著相關(guān)，全基因組關(guān)聯(lián)分析鑒定亦顯示攜帶變體rs12041331者的血小板聚集功能最強。Pi等[15]發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因多態(tài)性，特別是位點rs12041331和位點rs12566888，與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病密切相關(guān)，PEAR1基因多態(tài)性并不能表明川崎病發(fā)生的易感性，但rs12041331多態(tài)性與川崎病中冠狀動脈瘤形成的風(fēng)險增加有關(guān)。Faraday等[16]發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因位點rs12041331內(nèi)含子的變異可增加PEAR1蛋白的表達，后者除增強血小板的聚集性外，還可能存在其他潛在的功能。除此之外，還有研究表明PEAR1基因多態(tài)性可影響血小板聚集率，并與血小板功能和抗血小板藥物藥效學(xué)有關(guān)[9]。Backman等[17]發(fā)現(xiàn)，PEAR1基因位點rs12041331變異通過削弱阿司匹林的抗血小板聚集作用，進而增加心血管事件風(fēng)險。石錦秀等[18]的研究顯示，中國人群中PEAR1基因位點rs12041331的野生G等位基因的分布頻率為0.61，突變A等位基因的頻率為0.39，PEAR1基因突變與血小板高活性具有相關(guān)性，PEAR1基因突變型(AG和AA)人群的血小板聚集率顯著高于野生型(GG)人群，突變基因型(AG和AA)患者使用阿司匹林(或聯(lián)合氯吡格雷)時的心肌梗死發(fā)生率和死亡率增高，隨著PEAR1的突變基因位點數(shù)量增加，血小板聚集率也逐漸增加。李建設(shè)等[19]在114例初發(fā)腦梗死患者中檢出3種PEAR1(位點rs12041331)基因型，分別是野生型GG(50.9%)、雜合突變型GA(42.1%)、純合突變型 AA(7.0%)，并進一步觀察到PEAR1基因突變與長期服用阿司匹林腦梗死患者的卒中復(fù)發(fā)有關(guān)，考慮PEAR1基因純合突變可增加卒中復(fù)發(fā)的風(fēng)險。

腦梗死具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高致殘率及高死亡率的特點，是造成全世界人口死亡和殘疾的重要原因之一[20]。以往臨床醫(yī)師都重視腦梗死患者肢體功能的恢復(fù)，而忽視了腦梗死后認知功能障礙的恢復(fù)，從而錯過了腦梗死后認知功能恢復(fù)的最佳時機，其造成的嚴重后果并不亞于肢體殘疾，也給整個家庭和社會都帶來沉重的負擔(dān)[21]。認知功能減退是急性腦梗死患者最常見的表現(xiàn)之一，卒中后認知功能障礙包括了從卒中后認知障礙非癡呆至卒中后癡呆的不同程度的認知障礙。其發(fā)生機制目前仍不明確，導(dǎo)致早期診斷及治療較為困難[22]。經(jīng)過積極治療和干預(yù)，可以延緩部分早期的卒中后認知障礙非癡呆患者的疾病進程。一旦發(fā)展到了卒中后癡呆階段，多表現(xiàn)為階梯式加重、波動病程的認知功能障礙，治療難度明顯加大[23]。卒中后認知功能障礙主要危險因素包括高齡、低受教育程度、復(fù)發(fā)性卒中等[24]，故需引起重視，做到早期評估、早期預(yù)防。

本研究結(jié)果顯示，AA組患者的高齡者比例、吸煙者比例高于GG組，LDL-C水平和NIHSS評分均高于GG組和GA組(均P<0.05)，提示PEAR1基因位點rs12041331的純合突變者有更多的卒中危險因子，且一旦發(fā)病，神經(jīng)功能受損更為嚴重。此外，AA組的MMSE評分低于GG組和GA組(P<0.05)，盡管GA組MMSE評分也低于GG組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這也初步提示PEAR1基因位點rs12041331的SNP可能與初發(fā)腦梗死患者卒中后認知功障礙的發(fā)生有關(guān)。

綜上所述，PEAR1基因位點rs12041331的純合突變可能增加初發(fā)腦梗死患者卒中后神經(jīng)功能缺損程度，以及認知功障礙的發(fā)生風(fēng)險。評估PEAR1基因多態(tài)性對評估初發(fā)腦梗死患者卒中后認知功障礙有一定的價值，這對于合理應(yīng)用相關(guān)藥物，加強患者的綜合管理，改善患者預(yù)后，提高生活質(zhì)量具有重要的意義。然而,由于PEAR1基因突變可以發(fā)生在多個基因位點上，而且存在種族差異[25]，本研究可能存在著一定的局限性。今后的研究應(yīng)該涉及多類人群，擴大樣本量，從更多的基因位點上著手研究其與腦梗死患者卒中后認知功障礙的相關(guān)因素。