酵母的大分子營養需求與轉運策略（Ⅰ）

俞麗燕，章亭洲

（浙江科峰生物技術有限公司固態發酵與生物飼料研究院，浙江海寧314423）

酵母是在發酵工業中應用最為廣泛的單細胞真核微生物，其培養物和提取物等酵母類產品也是一種綠色的飼料添加劑，在飼料工業中也有廣泛的研究和應用[1]。同時，酵母中的釀酒酵母是研究真核生物的模式物種，對于理解真核生物細胞內在規律具有重要意義[2-4]。不管是在基礎研究中，還是在應用研究中，酵母的培養都是非常關鍵的。從元素的水平來看，酵母所需營養元素與其他微生物類似，都是由大量元素和微量元素組成。但酵母在營養物質的需求、培養基組成成分和大分子營養物質的轉運方式上都有其自身的特點。

酵母的營養涉及酵母細胞如何被培養的問題，更具體地說，它指的是酵母細胞如何將培養基中的各類營養物質轉運至細胞內。膜運輸是營養物質選擇性吸收的關鍵，這是酵母細胞間相互作用和與周圍環境相通最基本的途徑。本文進一步討論了酵母細胞各種膜轉運機制。酵母的營養也指細胞用于生長和生存采取的合成代謝和分解代謝的基本營養物質來源。

了解酵母細胞的營養需求、獲取方式以及營養物質運輸，對實驗室培養酵母細胞和工業發酵的優化具有重要意義。

1 酵母的大分子營養需求

對100 g面包酵母進行元素分析，可以得出以下“經驗公式”：C47H6.3O33N8P1.2。由于酵母菌株和生長條件的差異，使得該方程式的變化較大，因而參考價值有限。但它仍對理解酵母細胞的營養構成具有一定幫助。

酵母細胞從生長環境中獲取各類營養元素。表1中總結了酵母細胞對元素的需求。

表1 酵母常見營養元素需求

大多數酵母菌可以在pH值為5.5時由己糖、銨鹽、各種礦物質、微量元素和少量維生素配置成的液體培養基中生長良好。然而，酵母細胞對營養的需求是多樣化的，這種多樣性將從酵母營養的化學來源來考慮。

1.1 碳

酵母菌是化能異養型微生物。這意味著它們從化合物的固定、有機物的化學鍵上獲得碳和能量。

酵母利用各種糖類作為碳源，包括己糖和戊糖等單糖、二糖和多糖。除提供碳源外，這些糖類分解代謝時也為酵母提供能源。實驗室中培養酵母最常使用的碳源是葡萄糖，但酵母在自然生境中能夠獲取的葡萄糖很少，通常利用纖維素、淀粉和其他多糖作為碳源。在工業發酵過程中，酵母利用麥芽糖、蔗糖、果糖和木糖等作為碳源。需要注意的是，葡萄糖能夠抑制酵母對其他糖類的同化吸收。葡萄糖并不是所有酵母細胞代謝最有效的糖。在自然棲息地（聚合纖維素、淀粉等多糖）或在許多工業發酵基質（麥芽糖、蔗糖、果糖、木糖和乳糖是更常見的糖）中酵母菌并不能直接獲取葡萄糖。

不同酵母菌對不同碳源的吸收利用程度不同，見表2。對釀酒酵母來說，葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖被認為是良好的生長和發酵底物，其他碳源（如乙醇和醋酸鹽）只能在釀酒酵母中作為呼吸底物存在。

表2 酵母生長所需的各種碳源

酵母菌是化能異養型微生物，但也有一小部分酵母菌（約占總酵母種類的5%）可通過同化二氧化碳獲得所需碳源。在氨基酸生物合成的三羧酸循環中取代二羧酸的反應中，以及脂肪酸、嘌呤和嘧啶的生物合成中，二氧化碳的固定是必要的。因此，二氧化碳也應該被認為是酵母營養的碳“基質”。

1.2 氫

酵母細胞的氫元素主要來自于碳水化合物。酵母在酸性環境（pH值為4～6）中生長良好，而在堿性環境中難以生長。與絕大多數細菌相比，酵母耐受的pH值更低。這種特性幫助酵母占據不同的生態位以及存在于腐敗的酸性食物中。氫離子（質子）對于酵母細胞的生理功能至關重要，細胞外和細胞內pH值的變化顯著影響酵母細胞的生長和代謝。例如，酵母細胞利用葡萄糖生長的最佳pH值是6.5，而發酵的最佳pH值是5.0[5]。當初始培養基的pH值在4～6，酵母細胞通常生長的非常好，但許多酵母能夠在相當寬的pH值范圍內（2～8）生長。通常酵母細胞不能很好地在堿性條件下生長，但某些海洋酵母特別適合在弱堿性海水中生長。活躍生長的酵母細胞通過離子吸收、營養物質運輸過程中離子分泌、有機酸分泌和CO2的釋放等方式組合來使培養基酸化。乙醇的發酵對中等pH值的變化特別敏感。通過質膜質子泵ATPase的作用將細胞內pH值調節在相對狹窄的范圍內，對酵母細胞營養物質吸收和代謝起著重要作用。除培養基包含乙酸鹽或山梨酸鹽等有機酸外，細胞外pH值變化對酵母胞質pH值的影響有限。

1.3 氧

盡管酵母能夠在厭氧條件下發酵，但在完全沒有氧氣的環境中酵母不能很好地生長。氧氣不僅能為呼吸相關的酶提供底物，還是甾醇和不飽和脂肪酸生物合成過程中羥基化所必須的。具體來說，酵母細胞需要分子氧用于多功能氧化酶介導的三十碳六烯-2,3-環氧化物形成羊毛甾醇，以及用于合成不飽和脂肪酰基輔酶-A酯。在無氧條件下，釀酒酵母生長需要麥角甾醇和油酸，消除了其可以真正厭氧生長的觀念。因此，氧含量被認為是酵母細胞生長的重要影響因素。

不同酵母對分子氧的需求不同，純氧對酵母細胞的生長具有強烈的抑制作用。高壓氧對酵母細胞的毒性與細胞周期有關。

酵母工業中對于細胞呼吸生長的優化至關重要，生物反應器中需要維持足夠的氧濃度，從而支持酵母的快速生長。

在特定的酵母生物技術領域中，呼吸作用促進細胞生長至關重要（例如面包酵母和酵母生物質蛋白產業），為保證酵母細胞的快速生長必須在生物反應器中給予足夠的氧氣。氧氣微溶于水，酵母繁殖過程中發展出各種提高氧氣吸收率的生物工程方法，氧氣的傳遞速率表示為KLac（KL是大氣O2通過液體界面進入溶液的速率，a是界面的面積，c是介質中的氧濃度）。在實驗室中，用于搖瓶培養的鋸齒狀凹痕，能顯著增加KLac值，改善氧轉移，從而促進酵母的生長。此外，在釀造發酵中，常認為是純厭氧發酵，初始氧氣和種子液有氧生長與隨后的發酵極其重要。

1.4 氮

酵母中氮元素約占細胞干重的10%。酵母不能固定分子氮，其廣泛使用的氮源包括無機氮源和有機氮源。酵母培養基中最常使用的氮源是硫酸銨；有些酵母可以利用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為氮源。硝酸鹽同化能力長期以來被用作某些酵母屬的生理鑒別依據。例如，Hansenulaspp.是硝酸鹽陽性的，Pichiaspp.歸類為硝酸鹽陰性。類似地，對于尿素，大多數擔子菌酵母是脲酶陽性的，而大多數子囊酵母是脲酶陰性的。

常見的有機氮源包括氨基酸、肽類、嘌呤、嘧啶和胺等，其中谷氨酸和天冬氨酸可以作為良好的氮源。

在工業發酵培養基中，麥芽汁與氨基酸混合物被酵母細胞的吸收順序見表3。對于某些實驗室酵母培養基，氨基酸混合物也可促進生長，也可以以蛋白質水解物的形式提供氮源。但是單獨添加胱氨酸、甘氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸或蘇氨酸不能使釀酒酵母很好地生長。有些酵母菌雖然不是常規的Saccharomycesspp.，但能夠利用細胞外蛋白酶分泌后產生的氨基酸和低分子質量肽。

表3 啤酒酵母對氨基酸的吸收順序

1.5 硫

酵母對硫元素的需求主要是合成含硫的氨基酸，硫含量約占細胞干重的0.3%。很多含硫化合物都能為酵母提供硫元素，如硫酸鹽、亞硫酸鹽、硫代硫酸鹽、甲硫氨酸和谷胱甘肽等。無機硫和甲硫氨酸是酵母硫代謝中最重要的兩種化合物，其中甲硫氨酸在酵母營養中是使用效率最高的氨基酸[6]。

1.6 磷

磷存在于核酸和磷脂中，對所有酵母菌都是必需的。酵母細胞質負電荷是由于有機化合物中存在無機磷酸鹽和磷酸鹽基團。酵母細胞的磷酸鹽含量約占細胞干重的3%～5%，主要是以正磷酸鹽（H2PO4-）的形式存在。正磷酸鹽和濃縮無機磷酸鹽是酵母生長培養基中常見的磷源。正磷酸鹽是許多酶的底物和效應體，包括那些參與能量轉導的酶。胞質磷酸鹽在酵母細胞中含量很低，約為細胞干重的0.2%。然而，這取決于酵母細胞所采用的糖分解代謝模式。例如，當細胞表現出短期的Crabtree效應時，在葡萄糖脈沖期間，細胞內磷酸鹽顯著上升。酵母還可以有效地將磷酸鹽儲存在細胞器中，L.A.Okorokov[7]等研究表明，液泡中的磷酸鹽濃度比細胞質高110倍。

1.7 常量金屬元素（K、Na、Ca、Mg）

酵母對無機元素的需求與其他微生物類似，包括大量元素和微量元素。大量元素所需濃度為毫摩爾范圍，如K和Mg。

酵母的生長對鉀有絕對需求，鉀是各種酶的輔助因子，這些酶參與氧化磷酸化、蛋白質生物合成和碳水化合物代謝。鉀也參與到磷酸鹽等其他營養素的吸收，可以作為非特異性電荷平衡劑以及大分子和核糖體的穩定劑。酵母細胞中的鉀含量隨生長條件變化而變化，通常占細胞干重的1%～2%。H.Aiking等[8]限制鉀濃度培養產朊假絲酵母，試驗證明細胞內鉀的含量隨酵母生長速率的線性變化而變化。就控制生長速率和利用率而言，K+的類似物Rb+是唯一可以替代K+的堿性金屬陽離子。J.Perkins等[9]研究發現，在深紅酵母菌（Rhodotorula rubra）的丙酮酸激酶活化中，除了Rb+外，NH4+離子也可以部分替代K+。

雖然部分酵母菌在氯化鈉溶液中能較好地生長，但沒有證據表明酵母細胞在低鹽濃度下需要鈉離子。耐鹽酵母，如Debaryomyces hanseni,Pichia miso和Zygosaccharomyces rouxii，已經適應了特殊的滲透調節機制，可以在高濃度NaCl溶液中生長。酵母對滲透壓脅迫和離子脅迫的生理反應將在后文中進一步討論。

鎂是酵母生長的絕對必需元素，占細胞干重的0.3%，在細胞結構和代謝功能方面起著重要的作用。例如，轉磷酸酶依賴于Mg2+離子，涉及遺傳信息的合成、表達和翻譯的酶也依賴于Mg2+離子。酵母細胞Mg2+含量隨生長條件和細胞周期變化。沒有其他陽離子可以替代Mg2+對酵母細胞生理進行影響，盡管在Mg2+限制生長的情況下，酵母細胞可以合成亞精胺和腐胺等陽離子多胺。

酵母細胞生長所需鈣離子含量存在分歧。據報道鈣濃度可低至10-9mol·L-1。由于必需的Mg2+依賴性功能的拮抗作用，高水平的Ca2+可能會抑制酵母的生長。

R.P.Jones等[10-11]綜述了礦物質離子對酵母細胞發酵的作用和影響。利用元素質量平衡和程序搜索技術計算了幾種促進酵母生長的陽離子和陰離子的最佳水平。然而，由于菌株差異、培養基螯合和離子相互作用等因素，很難對離子需求進行精準定量。關于后者，G.Chandrasena等[12]已經開發了一種模型，以確定陽離子相互作用，用于預測酵母發酵性能。

2 酵母的培養與培養基

酵母對營養的需求相對簡單，因此培養酵母較為容易[3-4]。實驗室中廣泛用于酵母培養的天然培養基有兩種：一種是麥芽提取物肉湯（MEB）；另一種是由酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖組成的培養基，用于實驗室菌株日常維護。Schwanniomyces occidentalis、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Yarrowia lipolytica、Candida maltosa和Trichosporon cutaneum等 酵 母 均有專門的培養基配方，用于培養、產孢。實驗室中常用的其他復雜酵母培養基包括：醫學上重要酵母菌培養所用的Sabouraud培養基（葡萄糖加真菌性蛋白胨），釀酒酵母培養所用的合成培養基Yeast nitrogen bases可用于碳同化和發酵測試。也可以使用Yeast carbon base，它需要補充氮源。其他合成培養基也被開發用于實驗室培養酵母，例如Edinburgh minimal medium培養基被開發用于Schizoscharomyces pombe的生長。為了使合成培養基更加豐富，可以添加酵母提取物，就變成了“半合成培養基”。

在發酵工業中，通常利用糖蜜和麥芽汁等價格低廉的副產品來培養酵母[13]，但需要注意以下幾點：一是酵母繁殖培養基可能不適用于酵母發酵，低濃度糖蜜阻止葡萄糖抑制效應，從而促進酵母呼吸，而高濃度糖蜜有利于酵母發酵；二是在培養基中適當加入一些營養物質混合物，有利于酵母發酵；三是有些工業發酵培養基中可能含有少量抑制酵母生長的有毒物質，如糖蜜連續加熱后會發生焦糖化反應，從而產生焦糖和糖醛類物質。

酵母的選擇培養基中通常添加某些抗細菌劑、抗真菌劑和抗酵母劑，通過選擇性抑制其他微生物的生長將酵母分離出來。鑒于酵母生長的pH值較低，也可以使用酸性瓊脂培養基（pH值為3.7）從土壤中分離酵母，此時絕大多數細菌的生長受到抑制。在釀造酵母的存在下，結晶紫加上品紅-亞硫酸鹽可以選擇性地用于測定野生型酵母。環己酰亞胺對某些酵母菌有選擇性抑制作用，可用于檢測釀造樣品野生酵母菌的存在。也可以使用特定培養基來選擇具有特定營養要求的酵母。例如，食品樣品中的魯氏酵母可用高滲透壓的培養基，啤酒樣品中的非野生酵母可用賴氨酸（作為唯一的N來源）瓊脂培養基。

在工業應用中酵母培養基的使用應注意以下幾點。首先，酵母繁殖培養基不一定適用于發酵。例如，糖蜜用于酵母細胞積累生物量和生產乙醇。酵母細胞積累生物量，必須通過控制營養攝入使糖同化保持在較低水平，以防止葡萄糖抑制和促進呼吸代謝。酵母細胞生產乙醇，由于需要發酵代謝，糖水平可以保持很高。使用糖蜜，還需要解決其他關鍵營養物質的供應問題。例如，糖蜜中可利用的氮和磷酸鹽的含量低，需要適當地補充以保證酵母的正常生長。Mg2+等必需陽離子的濃度也需要加以注意。

一些酵母發酵得益于添加培養基補充劑或酵母提取物。例如，麥芽汁通常被認為是一種完全發酵培養基，但也有人提倡在麥芽汁中添加混合營養物質以平衡酵母發酵期間的營養供應。少量補充氨基酸、小肽、脂類、礦物質和維生素的混合物，可以保證酵母活性的一致性，從而最大程度地減少產品風味變化。

一些工業發酵培養基中可能含有少量的對酵母有毒或抑制生長的化合物。某些化合物可能是在培養基滅菌或巴氏滅菌的熱處理過程中產生的。例如，糖蜜過度加熱與氨基氮化合物之間的美拉德反應，產生不需要的焦糖化產物。熱還可能破壞維生素和酵母生長必不可少的其他生長因子。

當使用恒化器對酵母進行連續培養時，需要將營養物質持續不斷地加入到培養容器中，同時以同樣的流速不斷流出培養物，從而將培養容器中的培養物維持在恒定的體積。此時的培養液中某一種營養物質為生長限制因子，通過控制其濃度，使得酵母以一定的生長速率生長。恒化器可以用來測定酵母的比生長速率，對于理解酵母營養和代謝等諸多方面具有重要意義。

生化培養箱對細胞生理學家了解酵母營養的不同需求非常有用。例如，優化培養基成分、研究糖的運輸和代謝、確定不同酵母物種對同一糖的競爭或混合糖中對單一物種的競爭。

酵母菌同鄰近微生物的競爭優勢與營養物質的吸收率有關。酵母需要以特定的速率將有機和無機溶質轉移到細胞內，該速率將影響細胞生長的速率。酵母細胞膜控制營養物質的運輸速率，可以用營養物轉運親和常數和溶質轉運通量（單位時間內膜單位表面積運輸的摩爾數）來描述。因此，計算不同溶質和不同酵母的米氏常數值有助于了解營養物的轉運親和力，當米氏常數值較低時表示較高的轉運親和力，而米氏常數值較高時表示較低的轉運親和力。例如，同一糖和同一酵母培養獲得兩個溶質轉運通值量（Kt值），表示糖被兩個過程吸收，并且生物體對糖的利用表現出雙相動力學。了解米氏常數值有助于理解酵母發酵過程中的糖攝取，特別是當存在混合底物或混合培養物時。例如，產朊假絲酵母（Candida utilis）對葡萄糖具有非常高的親和力，在食品工業釀酒酵母發酵過程中是潛在的污染物。這是因為釀酒酵母對葡萄糖具有較低的親和力，葡萄糖進入細胞膜采用單純擴散吸收而不是主動轉運吸收。

當細胞遭遇饑餓時，酵母菌會啟動營養物質獲得的其他生理反應。當缺乏必要的營養物質，如碳、氮或磷源時，酵母細胞的分裂周期通常阻止G1期開始而停留在G0期。有性繁殖的酵母菌，消耗碳或氮源可能形成孢子。在釀酒酵母中，孢子形成過程使葡萄糖轉運系統失活。U.Schulze等[14]對釀酒酵母中氮饑餓的生理效應進行了詳細的研究。當細胞缺乏銨離子時，胞內的RNA、蛋白質、海藻糖和糖原以及酵母的生長能都發生了巨大變化。

（下期待續）