HPLC 法測定五指毛桃中補骨脂素含量及質量評估

葉曉玲 賴吉儉 張錦炳

五指毛桃也稱五爪毛桃,主要應用于肝炎、脾虛浮腫等疾病治療［1］。有研究人員表明［2］,香豆素類是五指毛桃各成分中有效的成分之一,而補骨脂素便是一種呋喃香豆素類化合物,具有抗病毒、消炎等突出作用,在五指毛桃的各項組成成分中,補骨脂素是最為主要的一種有效成分［3］。此次研究獲取來自不同地區的10 批五指毛桃作為研究樣本,并采用HPLC 法進行提取,對波長進行設定,從而對五指毛桃進行鑒別和測定,為檢查等方面提供有效的依據。現報告如下。

1 一般資料

1.1 試驗藥材 此次獲取的補骨脂素是由中國藥品生物品鑒定所生產及提供的,CAS 號為66-97-7,批號為110739- 201617；所使用的乙腈由上海麥克林生化科技有限公司提供,貨號為A800361-5 ml,色譜純級別,超純水等,在其他研究過程中所用試劑為分析純。此次研究獲取的五指毛桃樣本來自廣西、廣東、云南、福建以及貴州等地,共10 批藥材樣本,將其進行編號為1#～10#,并將獲取的五指毛桃樣本做烘干處理,然后將其粉碎,過40 目篩后留備用。

1.2 試驗儀器 研究使用了由美國Waters 生產的高效液相色譜儀來進行試驗檢測,還使用了二極管陣列檢測器以及島津Shim-pack VP-ODS 色譜柱(規格為長250 mm,粒徑為5 μm,內鏡為4.6 mm),日本生產,產品貨號為228-34937-91,使用了由廣州瑞明儀器有限公司生產的高FA2104N 型電子分析天平,還使用了由北京天佑恒達科技有限公司生產的KQ5200 型超聲波清洗器。

2 方法及結果

2.1 色譜柱條件 此次試驗研究主要是將補骨脂素與獲取的樣本實施190～600 nm 的波長進行掃描,從而來對其最大吸收波長進行確定。

此次研究使用島津Shim-pack VP-ODS 色譜柱(規格為長250 mm,粒徑為5 μm,內鏡為4.6 mm)；將乙腈-(35∶64)設定為流動相,洗脫方式為等度洗脫；將流速設定為1.0 ml/min；檢測波長為246 nm,柱溫為34℃。在此條件下將補骨脂素及其對照品保留10 min左右。

2.2 制備供試品溶液 取出五指毛桃經處理后的粉末適量,并以《中國藥典》(2010 年版)［4］附錄中ⅡC方法操作規定為依據,對五指毛桃粉末進行顯微鑒別,同時以《中國藥典》(2010 年版)附錄中提及的ⅨH、ⅨK、ⅩC 方法為依據加以操作,分別對五指毛桃樣本中包含的灰分、水分以及醇性浸出物進行測定。

2.3 制作補骨脂素對照品的標準曲線以及精密稱量 將已完成制作的10.4 mg 補骨脂素置于10 ml 量瓶中,然后通過甲醇將其溶解,將容量確定為10 ml,然后使用精密測量儀器制備對照品溶液,溶液的濃度差分別為0.564、2.257、4.514、9.027、18.054、36.108、72.218、144.435 mg/L。然后從各種濃度的對照品溶液中吸取10 μl,使用色譜儀對其峰面積分別進行測量,將縱坐標設置成峰面積積分值,將橫坐標設置成補骨脂素對照品的量,然后通過線性回歸方式進行分析,通過分析得出結果為r=0.9997,線性范圍是0.5～290.0 μg。然后再使用精密儀器將對照品溶液吸取,取量為10 μl,依據研究過程中設置的色譜條件,重復檢測樣品,檢測次數為6 次,對所測峰面積進行記錄,通過分析顯示得出補骨脂素的峰面積RSD 值可達0.52%,這表明儀器的精密度較為良好,可對其進行使用。

2.4 穩定性評估 將同批次樣本供試樣溶液10 μl,通過精密儀器將其吸取,吸取量為10 μl,然后馬上對樣本補骨脂素的含量進行測定,并分別在2、4、12、24 h后通過同樣的測定方法進行測量,通過測量結果顯示,補骨脂素的鋒面值RSD 可達到0.64%,此測定結果說明此樣本在24 h 內的穩定性表現良好。

2.5 重復性檢測 以隨機的方式從10 份樣本中抽取出同批次五指毛桃,取量應為1 g,并將其制備成供試樣本,對每個樣本之中的補骨脂素含量進行檢測,通過檢測結果顯示RSD 可達1.82%,此結果說明這種方法具有良好的重復性。

2.6 加樣回收試驗 準備好濃度為210 mg/L 的1 ml補骨脂素,并將該材料加入到精密儀器之中,液體完成揮發之后,稱取同批次含補骨脂素的五指毛桃,稱取量為0.6 g,然后將其制備成供試樣本,通過檢測,其平均回收率均能夠達到90%以上,其中,RSD 可達1.926%,通過加樣回收試驗研究結果表明,此次研究所采取的全部方法具有良好的回收效果,詳細數據見表1。

表1 加樣回收試驗結果

2.7 檢測樣本含量 此次研究對各產地五指毛桃的粉末樣本進行了測量,樣本取量為1.0 g,通過HPLC 法對所選樣本進行檢測,通過檢測結果表明,所有五指毛桃樣本中補骨脂素的含量均在0.043%～0.069%之間,其中,廣東河源地區的五指毛桃補骨脂素含量最高,為0.069%,見表2。色譜圖見圖1。

圖1 補骨脂素對照品(A)與五指毛桃(B)高效液相色譜圖

表2 各樣本五指毛桃補骨脂素含量檢測結果匯總

3 討論

五指毛桃是桑科植物的一種,雖然其名字里面含有“桃”字,但其并不是桃,之所以稱之為“五指毛桃”主要是因其葉子長得像五指,并且葉片上分布著較多的細毛,當其果實成熟的時候,果實外表與毛桃非常相像,從而稱之為“五指毛桃”［5］。該植物具有較高的藥用價值,是健脾補肺、行氣利濕、舒筋活絡的專用中草藥［6］。有研究對五指毛桃的乙醇提取物的醋酸乙酯及氯仿進行了化學成分研究［7］,研究分離得到4 種化合物,之后又通過質譜法、核磁共振波譜法、薄層色譜法、紫外光譜法、紅外光譜法以及高效液相色譜法等方法進行了結構鑒定,通過鑒定得出,五指毛桃所含4 種主要化合物分別為補骨脂素、β-谷甾醇、佛手柑內酯以及鄰苯二甲酸二異丁酯［8］。

而從民族用藥經驗方面來看,五指毛桃被使用的疾病更加廣泛,例如肺氣腫、重癥肌無力等方面的疾病,五指毛桃均可發揮一定的功效［9］。當前國家地方相關藥物質量評價標準只是從TLC 鑒別一級性狀等方面來對五指毛桃的質量進行評價和檢測［10］,這種評測方式無法滿足五指毛桃大面積規模化種植的臨床需求。早于2004 年,我國發布了《廣東省中藥材標準》［11］,但作為盛產五指毛桃的大省,該標準中居然并未收錄五指毛桃的相關含量檢測項目,而從上述內容中可以了解到,其中包含的有效成分的極性比較小,通常采取極性較小的溶劑進行展開測定,通過甲苯-丙酮、正乙烷-醋酸乙酯、氯仿-正丁醇等一系列展開劑依據薄層色譜法來進行試驗［7,12］,通過補骨脂素對照品以及對照藥材來實施對照,即便是采取這些方法,五指毛桃的質量標準也未曾收錄［13］。所以應該構建更為科學合理的五指毛桃質量標準,從而使《廣東省中藥材標準》得以完善,并且還能夠為《中國藥典》構建質量標準體系創造相應的參考條件。可見五指毛桃的藥學價值是非常大的［14］。

在本次研究中,通過HPLC 法對五指毛桃進行提取過程中,對其樣本采集、試劑提取、波長測量等實施了細致的研究,最后對HPLC 提取的具體流程進行了確定,最后選擇了流動性乙腈-水完成分離,采用甲醇進行提取,超聲波提取,通過此次研究結果顯示,補骨脂素的提取方法具有較高的精密度,并且在穩定性方面也比較高,在可重復性方面比較強,這些研究結果充分證實了該研究方法的有效性,可以作為五指毛桃質量控制的相關參考依據。同時,此次研究還進行了加樣回收試驗,經試驗研究得出,檢測的平均回收率均可達到90%以上,平均回收率可達到99.56%,RSD 為1.926%,說明此次研究的方法具有良好的回收效果,最后,對樣本含量進行了檢測,主要檢測了10 個樣本補骨脂素含量,經檢測得出,10 個樣本中補骨脂素含量最高為0.069%,最低含量為0.043%。此外,此次研究結論彌補了以往研究中的不足,例如,上文所述研究并未對不同產地五指毛桃作為研究,僅對不同采收年份、不同類型品種以及不同采收季節三個方面得出研究結果,而本次研究則選擇了我國10 個市對五指毛桃中補骨脂素的含量及質量標準進行研究,并得出廣東河源的五指毛桃補骨脂素的含量最高,這也是該地區規模化種植五指毛桃的主要依據,對不同產地五指毛桃中補骨脂素含量的研究便是對當前研究不足的完善。

綜上所述,經過程序優化后的HPLC 法對補骨脂素的提取更加簡單快捷,可行性表現突出,并且能夠保證結果的準確性和穩定性,能夠對五指毛桃的質量評估提供有效依據,應予以推廣。