Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在成都地區(qū)有辛辣飲食習(xí)慣的白斑及癌變患者中的表達(dá)

萬(wàn)梓欣 鄭志建 黃美暢 陳宇 姚莉洪

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院病理科，成都610041

口腔白斑（oral leukoplakia，OLK）是指發(fā)生在口腔黏膜上的不能被擦掉的白色斑塊，經(jīng)臨床和病理學(xué)檢測(cè)不能診斷為其他任何疾病者。OLK屬于口腔黏膜潛在惡性疾患[1]，有3%～5%的OLK可發(fā)展為口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），其轉(zhuǎn)變?yōu)镺SCC的風(fēng)險(xiǎn)比正常人高50～100倍，平均癌變病程達(dá)8.2年[2-3]。因此，OLK惡變潛能的評(píng)價(jià)及早期干預(yù)對(duì)OSCC的預(yù)防有重要意義。

由于氣候、文化等自然和社會(huì)因素的影響，成都地區(qū)人群喜食辛辣食物[4]。近年來(lái)，隨著人們對(duì)“飲食對(duì)健康的影響”關(guān)注度的提高，辛辣飲食在OLK癌變過(guò)程中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。目前關(guān)于辛辣飲食在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用仍有較大爭(zhēng)議。部分研究[5]認(rèn)為食用辛辣刺激性食物是導(dǎo)致上消化道癌變的主要誘因之一，部分研究[6]認(rèn)為辛辣飲食是腫瘤發(fā)生發(fā)展的保護(hù)因素，還有研究[7]認(rèn)為辛辣飲食與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間無(wú)明顯相關(guān)性。但是，關(guān)于辛辣食物與OLK癌變的相關(guān)關(guān)系目前尚無(wú)研究[8]。在OLK治療上，要求患者清淡飲食，消除刺激性食物對(duì)口腔黏膜的刺激，提示辛辣飲食對(duì)OLK癌變可能有促進(jìn)作用。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在有辛辣飲食習(xí)慣的成都地區(qū)OLK及癌變患者中的表達(dá)，分析其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，旨在探討分子標(biāo)記物在早期預(yù)測(cè)有辛辣飲食習(xí)慣OLK患者癌變過(guò)程中的意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 收集整理2016年1—12月四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院病理科存檔的45例患者的OLK蠟塊。實(shí)驗(yàn)組為有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者（30例），其中OLK不伴上皮異常增生（OLK-）、OLK伴輕-中度上皮異常增生（OLK+）、OLK伴重度上皮異常增生或癌變（OLK++/OSCC）患者各10例；納入標(biāo)準(zhǔn)：成都地區(qū)，臨床和組織病理活檢均診斷為口腔黏膜OLK，每周至少有3 d吃辣且持續(xù)5年以上，術(shù)前未行放化療。對(duì)照組為無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者（15例），其中OLK-組、OLK+組、OLK++/OSCC組各5例；納入標(biāo)準(zhǔn)要求患者每月至多1 d吃辣，即無(wú)辛辣飲食習(xí)慣，其他同實(shí)驗(yàn)組。所有切片均由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的副主任醫(yī)師職稱(chēng)以上的病理科醫(yī)師重新閱片確認(rèn)。

1.1.2 試劑 鼠抗人Ki-67單克隆抗體（1∶800）、兔抗人Cyclin D1單克隆抗體（1∶100）、鼠抗人P53單克隆抗體（1∶800）、鼠抗人P16單克隆抗體（1∶200）（福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），二抗及DAB顯色試劑盒（徠卡生物系統(tǒng)上海貿(mào)易有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用Leica BOND-MAX全自動(dòng)免疫組化染色儀對(duì)標(biāo)本進(jìn)行Ki-67、Cyclin D1、P53、P16單克隆抗體染色。用已知陽(yáng)性的標(biāo)本做陽(yáng)性對(duì)照，磷酸鹽緩沖液代替一抗做陰性對(duì)照。

由2位病理專(zhuān)家雙盲獨(dú)立閱片，每例組織切片在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400）。Ki-67、Cyclin D1和P53陽(yáng)性表達(dá)于胞核，呈棕黃色反應(yīng)；P16陽(yáng)性主要定位于胞漿，少部分位于胞核，呈棕黃色顆粒。

陽(yáng)性結(jié)果判定采用半定量積分法。1）首先對(duì)染色程度進(jìn)行評(píng)分：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；2）再按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：≤5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分；3）染色程度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分相乘即為總積分，＜1分為陰性，≥1分為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（n）和百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)或Fisher四格表確切概率法進(jìn)行檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，雙側(cè)P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者的臨床基本資料分析

有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者的臨床基本資料情況見(jiàn)表1。統(tǒng)計(jì)分析表明，性別、年齡、發(fā)病部位等參數(shù)在有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK-組、OLK+組和OLK++/OSCC組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者的臨床基本資料Tab 1 Basic clinical data analysis of OLK and cancerous patients with or without spicy diet

2.2 Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者中的表達(dá)

不論有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者，Ki-67在OLK-組均以陰性表達(dá)為主，少量陽(yáng)性細(xì)胞主要集中在基底副基底層；在OLK+組和OLK++/OSCC組均以陽(yáng)性表達(dá)為主，陽(yáng)性細(xì)胞擴(kuò)散至棘層且彌漫性分布，即基底上層模式（圖1、2）。統(tǒng)計(jì)分析（表2）表明，在有辛辣飲食習(xí)慣患者中，Ki-67在OLK+組和OLK++/OSCC組的表達(dá)高于OLK-組（P＜0.05），但OLK+組和OLK++/OSCC組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者中，Ki-67各組間的表達(dá)差異與無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者一致。Ki-67表達(dá)在有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK各組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

圖1 Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在有辛辣飲食習(xí)慣的OLK各組中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)Fig 1 Expression of Ki-67,Cyclin D1,P53 and P16 in every group with spicy diet immunohistochemistry

不論有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者，Cyclin D1在OLK-組表達(dá)均較弱，OLK+組表達(dá)稍有增強(qiáng)，在OLK++/OSCC組大都呈強(qiáng)陽(yáng)性著色（圖1、2）。統(tǒng)計(jì)分析（表2）表明，在有辛辣飲食習(xí)慣患者中，Cyclin D1在OLK++/OSCC組的表達(dá)高于OLK-組（P＜0.05），但其余組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者中，Cyclin D1各組間的表達(dá)差異與有辛辣飲食習(xí)慣患者一致。Cyclin D1表達(dá)在有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK各組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

不論有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者，P53在OLK-組均呈弱陰性表達(dá)，而在OLK+組和OLK++/OSCC組均呈強(qiáng)陽(yáng)性著色（圖1）。統(tǒng)計(jì)分析（表2）表明，在有辛辣飲食習(xí)慣患者中，P53在OLK+組和OLK++/OSCC組的表達(dá)高于OLK-組（P＜0.05），但OLK+組和OLK++/OSCC組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者中，P53各組間的表達(dá)差異與伴有辛辣飲食習(xí)慣患者一致。P53表達(dá)在有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK各組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

圖2 Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK各組中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)Fig 2 Expression of Ki-67，Cyclin D1，P53 and P16 in every group without spicy diet immunohistochemistry

不論有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者，P16在OLK-組陽(yáng)性表達(dá)均較強(qiáng)，棕黃色顆粒在基底副基底層彌散分布，甚至可達(dá)棘層；而在OLK+組和OLK++/OSCC組表達(dá)呈減弱趨勢(shì)，尤其OLK++/OSCC組以陰性表達(dá)為主（圖1）。統(tǒng)計(jì)分析（表2）表明，在有辛辣飲食習(xí)慣患者中，P16在OLK++/OSCC組的表達(dá)低于OLK-組（P=0.048），其余組別間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在無(wú)辛辣飲食習(xí)慣患者中，P16各組間的表達(dá)差異與伴有辛辣飲食習(xí)慣患者一致。P16表達(dá)在有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK各組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在有/無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK各組中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果Tab 2 Immunohistochemistry staining results of Ki-67,Cyclin D1,P53 and P16 in every group with or without spicy diet

2.3 Ki-67、Cyclin D1、P53和P16的表達(dá)與有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者臨床病理資料的關(guān)系

由于Ki-67、Cyclin D1、P53和P16的表達(dá)在有和無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK患者中無(wú)差異，因此，僅對(duì)有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者進(jìn)行分析。

Ki-67、Cyclin D1、P53、P16的表達(dá)與有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者臨床病理資料的關(guān)系見(jiàn)表3。統(tǒng)計(jì)分析表明，Ki-67、Cyclin D1、P53和P16的表達(dá)在不同性別、年齡、發(fā)病部位之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 Ki-67、Cyclin D1、P53、P16的表達(dá)與有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者臨床病理資料的關(guān)系Tab 3 The relationship between the expression of Ki-67,Cyclin D1,P53,P16 and the clinicopathological data of OLK and cancerous patients with spicy diet

2.4 Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者中表達(dá)的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析（表4）表明，有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者中Ki-67的表達(dá)與Cyclin D1成正相關(guān)（r=0.439，P=0.015）；其余分子標(biāo)記物之間的表達(dá)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。

表4 Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在有辛辣飲食習(xí)慣的OLK及癌變患者中表達(dá)的相關(guān)性Tab 4 Correlation of Ki-67,Cyclin D1,P53 and P16 expression of OLK and cancerous patients with spicy diet

3 討論

Ki-67表達(dá)隨異常增生程度的加重而呈上升趨勢(shì)，因此被廣泛用作細(xì)胞增殖標(biāo)記物[9-10]。在正常口腔黏膜和良性病變中，Ki-67微弱表達(dá)于基底層細(xì)胞，提示其具有一定的分裂增殖能力；在分化較好的腫瘤中，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)于癌巢周邊；在低分化腫瘤中Ki-67呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且著色彌散分布[11]。在本研究中，Ki-67在OLK+組和OLK++/OSCC組的表達(dá)顯著高于OLK-組，與既往研究結(jié)果一致。但在本研究中OLK+組和OLK++/OSCC組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因?yàn)镺LK+組和OLK++/OSCC組的定義受主觀因素影響較大，不同研究對(duì)異常增生程度的判定可能有所區(qū)別；此外，大多數(shù)研究分組為OLK組、OLK伴上皮異常增生組和OSCC組，缺乏異常增生和OSCC之間的過(guò)渡狀態(tài)，使Ki-67在兩組間的表達(dá)差異較明顯，而本研究在分組上更呈現(xiàn)出OLK癌變的一個(gè)動(dòng)態(tài)的連續(xù)性過(guò)程。

Cyclin D1的過(guò)表達(dá)可加速細(xì)胞從G1期到S期的轉(zhuǎn)換，致細(xì)胞增殖失控而惡性化，目前已在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)Cyclin D1的過(guò)表達(dá)[12-13]。姜倩[3]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D1在正常黏膜、單純?cè)錾蚈LK、異常增生型OLK和OSCC中的表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，陽(yáng)性率分別為20.00%、58.33%、72.22%和81.08%（P＜0.05），提示隨著OLK進(jìn)展，細(xì)胞的增殖活性顯著增強(qiáng)。在本研究中，Cyclin D1在OLK++/OSCC組的表達(dá)高于OLK-組，與Cyclin D1的作用機(jī)制及既往研究一致；但OLK+組和其余兩組間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總體而言，Cyclin D1的表達(dá)隨其惡性程度升高而升高。

P53基因是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類(lèi)腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因。P53基因有野生型和突變型兩種，野生型P53在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞惡性增殖中起重要作用，而突變型P53的產(chǎn)物不僅結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，穩(wěn)定性增強(qiáng)，失去抑癌作用，還能促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，有利于腫瘤發(fā)生[14-15]。李群等[16]研究發(fā)現(xiàn)，P53在正常黏膜、單純?cè)錾鶲LK、異常增生OLK和OSCC中的陽(yáng)性率分別為0.0%、13.3%、52.6%和78.4%，提示P53突變與口腔黏膜上皮細(xì)胞從單純?cè)錾虍惓Ｔ錾D(zhuǎn)化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，P53在OLK+組和OLK++/OSCC組的表達(dá)高于OLK-組（P＜0.05），說(shuō)明P53突變也參與有辛辣飲食習(xí)慣的OLK患者癌變的早期階段；結(jié)合P53的作用機(jī)制，進(jìn)一步提示基因組不穩(wěn)定性的增加與OLK癌變相一致。

P16基因突變、缺失或甲基化等導(dǎo)致功能缺失時(shí)，則失去對(duì)細(xì)胞分裂的負(fù)性調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞惡性增殖甚至癌變[17-18]，該機(jī)制在多種腫瘤的研究中得到證實(shí)，如宮頸癌、膀胱癌、消化系統(tǒng)腫瘤、頭頸癌等[19]。程曉華等[20]發(fā)現(xiàn)P16在正常黏膜、單純?cè)錾蚈LK、異常增生型OLK和OSCC中陽(yáng)性率依次下降，認(rèn)為P16表達(dá)下降可以作為OLK癌變的指征之一。本研究發(fā)現(xiàn)P16在OLK++/OSCC組的表達(dá)高于OLK-組（P＜0.05），提示有辛辣飲食習(xí)慣的OSCC患者組織中也存在明顯的P16蛋白表達(dá)缺失，它的減少使細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用減弱，易于發(fā)生癌變。這些研究均提示隨著OLK病變進(jìn)展，P16蛋白的表達(dá)水平下降，P16蛋白表達(dá)的缺失可作為OLK癌變的早期分子標(biāo)記物。

OLK的癌變與原癌基因和抑癌基因的表達(dá)失衡有關(guān)，在正常情況下這兩種基因處于動(dòng)態(tài)平衡，相互制約；但在外界或遺傳因素作用下，原癌基因過(guò)度表達(dá)或抑癌基因表達(dá)不足，誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度增殖甚至發(fā)生癌變[11,19]。腫瘤的發(fā)生是多基因相互作用的結(jié)果。本研究中原癌基因Cyclin D1、突變型抑癌基因P53的過(guò)表達(dá)及抑癌基因P16失活的同時(shí)出現(xiàn)也為這一學(xué)說(shuō)提供佐證。作為細(xì)胞周期正、負(fù)調(diào)控因子，P16可與Cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CDK4/CDK6，研究[21-22]發(fā)現(xiàn)Cyclin D1與P16在OSCC中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。但在本研究中，這兩個(gè)因子的表達(dá)雖呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），可能原因?yàn)楸狙芯恐袑⒅囟壬掀ぎ惓Ｔ錾蚈LK和OSCC早期階段作為一組，而對(duì)方研究中探討分析的是這兩個(gè)分子在OSCC中的表達(dá)相關(guān)性，因此造成結(jié)果的差異，兩者的具體關(guān)系有待進(jìn)一步大樣本研究。本研究發(fā)現(xiàn)在OLK癌變過(guò)程中，Ki-67和Cyclin D1在組織中的表達(dá)成正相關(guān)（r=0.439，P=0.015），進(jìn)一步說(shuō)明原癌基因Cyclin D1的過(guò)表達(dá)可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)OLK癌變的發(fā)生。

本研究結(jié)果表明，Ki-67、Cyclin D1和P53的表達(dá)隨OLK病變的進(jìn)展而升高，P16的表達(dá)隨病變進(jìn)展而降低。但是，Ki-67、Cyclin D1、P53和P16在有辛辣飲食習(xí)慣的OLK患者和無(wú)辛辣飲食習(xí)慣的OLK患者之間的表達(dá)無(wú)明顯差異。這與Ibiebele等[7]研究結(jié)果一致，其對(duì)澳大利亞食道癌患者進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查發(fā)現(xiàn)，辛辣食物的攝入頻率與食道癌的風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。提示：辛辣飲食與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間無(wú)明顯相關(guān)性。但是，Yan等[5]對(duì)中國(guó)黃河流域2 419例胃癌患者研究發(fā)現(xiàn)，飲食習(xí)慣是影響胃癌的一個(gè)重要因素，其中經(jīng)常食用油炸或燒烤食品、食用高鹽高脂和辛辣食品、飲用濃煮磚茶是與胃癌相關(guān)的3個(gè)重要因素。Phukan等[23]對(duì)502例印度食管癌研究發(fā)現(xiàn)，辛辣和熱燙飲食與食管癌風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。更為重要的是，部分研究認(rèn)為辛辣飲食是腫瘤發(fā)生發(fā)展的保護(hù)因素。姜黃、黑種草籽、生姜、大蒜、胡椒、辣椒等辛辣香料可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性，在肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌和宮頸癌等多種惡性腫瘤的預(yù)防和治療中有重要作用[6,24-25]。

結(jié)合目前對(duì)辛辣飲食與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究現(xiàn)狀和本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果，各研究者對(duì)辛辣飲食與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究結(jié)果不一致而引發(fā)爭(zhēng)議可能存在以下原因：缺乏用量化的指標(biāo)來(lái)定義辛辣食物攝入的程度，不同研究對(duì)辛辣飲食的判定標(biāo)準(zhǔn)不一致，即每周辛辣飲食頻率和每次攝入量達(dá)到多少算作辛辣飲食；與不同地區(qū)人群的個(gè)體差異性有關(guān)，不同種族人群的生活環(huán)境和生活習(xí)慣對(duì)辛辣飲食作用有一定的影響；口腔作為辛辣食物攝入的第一道關(guān)口，有可能受辛辣食物的危險(xiǎn)因素和保護(hù)因素的雙重作用；本研究樣本量較小，可能對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果的準(zhǔn)確性造成一定影響。因此，辛辣飲食對(duì)OLK發(fā)生發(fā)展的影響有待進(jìn)一步多中心和大樣本量研究，以增加結(jié)果的可靠性。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。