circ_0005379通過調控miR-17-5p/酰基輔酶A氧化酶1軸抑制口腔鱗狀細胞癌的發展進程

周海霞 王璐瑤 陳帥 王丹丹 方政

鄭州大學第一附屬醫院口腔醫學中心，鄭州450052

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見的頭頸部腫瘤之一，具有較高的發病率和死亡率。目前，OSCC的治療取得了較大進步，但患者5年生存率依然較低。研究[1]表明，OSCC細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲在OSCC發生發展過程中起關鍵作用。因此，深入探討OSCC發生發展的分子機制，可為該疾病的靶向治療提供新途徑。

環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類在哺乳動物體內廣泛存在的非編碼RNA，其可作為微小RNA（microRNA，miRNA）“海綿體”吸附miRNA進而調控靶基因的表達，在腫瘤的發生發展中起重要作用[2]。研究[3-4]已表明，circ_102459、circ_043621和circ_PVT1等多種circRNA參與OSCC的發生發展過程，可作為OSCC治療的分子靶點。circ_0005379是近年來新發現的一種circRNA，其對OSCC細胞惡性生物學行為的影響及機制還未明確。生物信息學軟件預測顯示，circ_0005379可能是miR-17-5p的“海綿體”，酰基輔酶A氧化酶1（acyl-CoA oxidase 1，ACOX1）可能是miR-17-5p的靶基因。研究[5]顯示，放射線照射可促進OSCC細胞系OC3表達miR-17-5p，抑制miR-17-5p表達增強了OC3細胞的放射敏感性。ACOX1是脂肪細胞內與脂肪酸氧化相關的酶，與腫瘤發生發展密切相關。ACOX1在OSCC組織中表達降低，過表達ACOX1可抑制OSCC細胞的遷移和侵襲能力[6]。miR-17-5p能否靶向調控ACOX1表達影響OSCC細胞的惡性生物學行為也還未知。本研究檢測了OSCC組織中circ_0005379、miR-17-5p和ACOX1蛋白表達水平，并以OSCC細胞SCC15為研究對象，miR-17-5p/ACOX1軸為切入點，觀察了過表達circ_0005379對OSCC細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其調控機制，以期為OSCC的靶向分子治療提供新途徑。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

選取2017年1月—2018年12月于鄭州大學第一附屬醫院口腔醫學中心行手術治療的51例OSCC患者為研究對象，其中男性29例，女性22例，平均年齡（58.34±7.95）歲。TNM分期Ⅰ和Ⅱ期23例，Ⅲ和Ⅳ期28例；高分化15例，中分化18例，低分化18例；淋巴結轉移19例，未轉移32例。對應癌旁組織為對照，病理檢測未發現癌細胞。所有患者術前未進行放療、化療等治療。研究經醫院倫理委員會批準同意，患者或家屬自愿簽署知情同意書。

1.2 細胞和實驗試劑

OSCC細胞系SCC15（中國科學院上海細胞庫）；正常口腔黏膜細胞HOK-16A（廣州吉妮歐生物科技有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI 1640培養基、四甲基噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、胰蛋白酶、LipofectamineTM2000試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測試劑盒、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；逆轉錄試劑盒和聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）；Trizol試劑（Invitrogen公司，美國）；鼠抗人ACOX1、上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）、β連環素（β-catenin）、Snail單克隆抗體（Abcam公司，美國）；circ_0005379過表達載體（circ_0005379）、空載體（Vehicle）、miR-17-5p模擬物（mimics）、模擬對照序列（miRNC）（廣州銳博生物科技有限公司）；免疫組化試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司）；PCR引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 用含10%FBS的RPMI 1640培養基培養SCC15細胞，培養箱環境：37℃、5%CO2、濕度97%。每2～3 d更換1次新鮮培養基。待細胞融合至80%時，吸棄培養基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例進行傳代培養。

1.3.2 實時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測基因表達 Trizol試劑提取組織或細胞中總RNA，微量核酸儀檢測RNA的純度和濃度。定量后，參照逆轉錄試劑盒說明書，將RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄總反應體系20μL，反應條件：42℃15 min，95℃3 min。然后以cDNA為模板進行RT-qPCR擴增，反應體系25μL，反應條件：95℃預變性60 s，95℃變性60 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共36次循環。引物序列如下。circ_0005379上游引物序列：5’-GCCCATACCTTTATCCACTC-3’，下游引物序列：5’-GTCAACATTCCAGTCTCTTCCT-3’；miR-17-5p上游引物序列：5’-TGCGGCAAAGTGCTTACAGTG-3’，下游引物序列：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）上游引物序列：5’-ACATCGCTCAGACACCATGG-3’，下游引物序列：5’-GTAGTTGAGGTCAATGAAGGG-3’；U6上游引物序列：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGG-3’，下游引物序列：5’-CC AGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。circ_0005379以GAPDH為內參，miR-17-5p以U6為內參，2－ΔΔCt法計算circ_0005379、miR-17-5p的相對表達水平。

1.3.3 細胞轉染 對數增殖期的SCC15細胞接種于6孔板中，待細胞融合至60%時，更換不含FBS培養基。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別將circ_0005379（circ_0005379組）、Vehicle（Vehicle組）、miR-17-5p mimics（miR-17-5p組）、miR-NC（miR-NC組）、circ_0005379與miR-17-5p（circ_0005379+miR-17-5p組）、circ_0005379與mi-R-NC（circ_0005379+miR-NC組）轉染至細胞。轉染48 h后，收集細胞用于后續實驗。

1.3.4 MTT檢測 細胞增殖轉染后的各組細胞以每孔5×103個接種于96孔板中，每組設置3個復孔。培養箱中分別培養24、48和72 h后，每孔加入20μL濃度為5 g·L-1的MTT。繼續孵育4 h后，吸棄培養基，加入150μL二甲基亞砜，振蕩混勻，于酶標儀490 nm處測定定光密度（optical density，OD）值。實驗重復3次，取平均值。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染后的各組細胞以每孔2.5×104個接種于24孔板中，每組設置3個復孔。培養48 h后，胰蛋白酶消化，PBS清洗細胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書，取1.0×106個細胞，加入500μL結合緩沖液，使用移液器輕輕吹打，混懸細胞。加入10μL Annexin VFITC，渦旋混勻，室溫避光反應10 min。加入5μL PI，渦旋混勻，室溫避光反應5 min。渦旋混勻后上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3.6 Transwell檢測細胞的遷移和侵襲能力 轉染后的各組細胞，調整濃度為每毫升5×104個。細胞遷移實驗：Transwell上室加入100μL細胞懸液，下室加入500μL含FBS的培養基。培養48 h后，吸棄培養基，取出小室，PBS沖洗2次，棉簽擦去上室上層細胞，小室置于4%甲醛中固定30 min。PBS沖洗，置于0.4%結晶紫溶液中染色15 min，PBS清洗至無染料殘留。風干后，顯微鏡觀察，隨機選取5個視野計數。細胞侵襲實驗：Transwell上室鋪Matrigel基質膠，自然晾干后加入100μL細胞懸液，后續操作與細胞遷移實驗相同。

1.3.7 Western blot法檢測細胞中ACOX1、E-cadherin、β-catenin和Snail蛋白表達 細胞培養48 h后，RIPA試劑提取細胞中總蛋白，BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白定量后取適量蛋白溶液于EP管中，100℃煮沸5 min，然后以每孔30μg蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，轉至聚偏乙烯二氟膜，并置于5%脫脂奶粉中封閉2 h。洗膜后，分別置于ACOX1（1∶500）、Ecadherin（1∶1 000）、β-catenin（1∶500）、Snail（1∶500）和GAPDH（1∶1 000）抗體孵育液中，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，置于加入辣根過氧化酶標記二抗（1∶2 000）孵育液中，37℃孵育1 h。洗膜后，加入電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯影液，避光顯影后凝膠成像系統曝光拍照。以GAPDH為內參，Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因實驗 Starbase生物信息學軟件預測顯示，miR-17-5p與circ_0005379、ACOX1 3’UTR均存在連續的結合位點。PCR分別擴增circ_0005379、ACOX1與miR-17-5p的結合片段，并克隆至pmirGLO載體上，獲得circ_0005379野生型質粒（circ_0005379-WT）及ACOX1野生型質粒（ACOX1-3’UTR-WT）。利用基因突變技術將結合位點突變后，獲得circ_0005379突變型質粒（circ_0005379-MUT）及ACOX1突變型質粒（ACOX1-3’UTR-MUT）。然后采用LipofectamineTM2000試劑盒分別將野生型和突變型質粒與miR-17-5p mimics、miR-NC共轉染至細胞。轉染48 h后，收集細胞。參照雙熒光素酶活性檢測試劑盒操作說明，檢測熒光素酶活性，結果以熒光蟲活性/海腎熒光強度比值表示各組的熒光素酶活性。

1.3.9 裸鼠移植瘤實驗 取對數生長期的SCC15細胞，轉染circ_0005379穩定表達的慢病毒載體（circ_0005379組）和攜帶無義序列的慢病毒載體（Vehicle組），將2組細胞接種至裸鼠后腿皮下。自觀察到肉眼可見的腫瘤時，每周用游標卡尺測量瘤體的長徑（a）和短徑（b），瘤體體積計算公式為：瘤體體積=a×b2/2。5周后，脫頸椎處死裸鼠，剝離腫瘤，PBS清洗后，濾紙吸干水分，稱重。RT-qPCR檢測腫瘤組織中circ_0005379和miR-17-5p表達水平，Western blot檢測腫瘤組織中ACOX1蛋白表達水平，方法同1.3.2和1.3.7。

1.3.10 免疫組織化學染色檢測異種移植腫瘤組織中ACOX1蛋白表達 移植瘤標本經4%甲醛固定，常規石蠟包埋后切片（厚度4μm）。常規脫蠟，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，進行免疫組化染色。高壓修復，0.3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，ACOX1一抗濃度為1∶150，4℃過夜。二抗37℃孵育20 min，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，復染脫水透明中性樹膠封片。結果判斷：腫瘤細胞核出現黃色顆粒為ACOX1陽性。

1.4 統計學分析

利用SPSS 22.0軟件對實驗結果進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示。2組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circ_0005379在OSCC組織及細胞中的表達

與癌旁正常組織比較，OSCC組織中circ_0005379表達降低（P＜0.05）（圖1左）。與HOK-16A細胞比較，SCC15細胞中circ_0005379表達降低（P＜0.05）（圖1右）。

圖1 circ_0005379在OSCC組織（左）及細胞系（右）中的表達Fig 1 The expression of circ_0005379 in OSCC tissues(left)and cell lines(right)

2.2 過表達circ_0005379對SCC15細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

與Vehicle組比較，circ_0005379組細胞中circ_0005379表達升高（P＜0.05），表明過表達circ_0005379的SCC15細胞構建成功。與Vehicle組比較，circ_0005379組細胞活性、遷移和侵襲細胞數及β-catenin和Snail蛋白表達降低（P＜0.05），凋亡率和E-cadherin蛋白表達升高（P＜0.05）（圖2）。

圖2 過表達circ_0005379對SCC15細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig 2 Theeffect of overexpression of circ_0005379 on theproliferation,apoptosis,migration and invasion of SCC15 cells

2.3 circ_0005379靶向結合并調控miR-17-5p表達

Starbase生物信息學軟件預測結果顯示，circ_0005379與miR-17-5p核苷酸序列存在連續的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-17-5p與circ_0005379-WT共轉染后的SCC15細胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），而與circ_0005379-MUT共轉染后SCC15細胞熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）（圖3A）。與癌旁組織比較，OSCC組織中miR-17-5p表達升高（P＜0.05）（圖3B）。與HOK-16A細胞比較，SCC15細胞中miR-17-5p表達升高（P＜0.05）（圖3C）。與Vehicle組比較，circ_0005379組細胞中miR-17-5p表達水平降低（P＜0.05）（圖3D）。

圖3 circ_0005379靶向結合并調控miR-17-5p表達Fig 3 circ_0005379 targets and regulates the expression of miR-17-5p

2.4 過表達miR-17-5p逆轉過表達circ_0005379對SCC15細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

與miR-NC組比較，miR-17-5p組SCC15細胞中miR-17-5p表達水平升高（P＜0.05）（圖4）。與circ_0005379+miR-NC組比較，circ_0005379+miR-17-5p組SCC15細胞活性、遷移和侵襲細胞數及β-catenin和Snail蛋白表達水平升高（P＜0.05），凋亡率和E-cadherin蛋白表達水平降低（P＜0.05）（圖4）。

圖4 過表達miR-17-5p逆轉過表達circ_0005379對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響Fig 4 Overexpression of miR-17-5p reverses the effect of overexpression of circ_0005379 on the proliferation,apoptosis,migration and invasion of SCC15 cells

2.5 miR-17-5p靶向調控ACOX1表達

Starbase生物信息學軟件預測結果顯示，miR-17-5p與ACOX1的3’UTR存在連續結合位點（圖5A）。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，miR-17-5p與ACOX1-3’UTR-WT共轉染后細胞熒光素酶活性降低（P＜0.05），而與ACOX1-3’UTR-MUT共轉染后的SCC15細胞熒光素酶活性無顯著變化（P＞0.05）（圖5B）。與癌旁組織比較，OSCC組織中ACOX1蛋白表達降低（P＜0.05）（圖5C）。與HOK-16A細胞比較，SCC15細胞中ACOX1蛋白表達降低（P＜0.05）（圖5D）。與miR-NC組比較，miR-17-5p組SCC15細胞中ACOX1蛋白表達降低（P＜0.05）（圖5E）。與Vehicle組比較，circ_00053-79組細胞中ACOX1蛋白表達升高（P＜0.05）；與circ_0005379+miR-NC組比較，circ_0005379+miR-17-5p組SCC15細胞中ACOX1蛋白表達降低（P＜0.05）（圖5F）。

圖5 miR-17-5p靶向并負調控ACOX1表達Fig 5 miR-17-5p targetsand negatively regulatestheexpression of ACOX1

2.6 裸鼠移植瘤實驗結果

與Vehicle組比較，circ_0005379組腫瘤體積和重量降低（P＜0.05），腫瘤組織中circ_0005379和ACOX1蛋白表達水平升高（P＜0.05），miR-17-5p表達水平降低（P＜0.05）（圖6）。免疫組織化學染色顯示，ACOX1在circ_0005379過表達的異種移植腫瘤組織中表達升高（P＜0.05）（圖6）。

圖6 過表達circ_0005379抑制裸鼠移植瘤生長Fig 6 Overexpression of circ_0005379 inhibits thegrowth of transplanted tumors in nudemice

3 討論

circRNA呈閉合環狀結構，具有高度的保守性和穩定性，在腫瘤等多種疾病中異常表達，有望成為新的診斷及預測腫瘤發生發展的生物標志物[7]。目前，已報道有多種circRNA在OSCC中異常表達，參與OSCC發生發展。Zhu等[8]研究顯示，circ_100533在OSCC組織和細胞系中表達降低，其作為miRNA海綿與miR-933結合上調GNAS表達，進而抑制OSCC細胞增殖、遷移，并促進細胞凋亡，可能是OSCC診斷生物標志物和有效治療靶標。Gao等[9]研究顯示，OSCC組織和細胞系中circ_PKD2表達降低，circ_PKD2過表達其作為miR-204-3p的海綿上調腺瘤性息肉病大腸桿菌2（APC2）表達，抑制OSCC細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡和細胞周期停滯，可作為OSCC的新型治療靶點。circ_0005379是近年來新發現的一種circRNA，其在OSCC中的作用機制還未明確。本研究顯示，circ_0005379在OSCC組織和細胞系中表達降低，過表達circ_0005379可降低OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲能力，并誘導細胞凋亡，與相關研究[10]結果一致，提示circ_0005379可能作為抑癌基因抑制OSCC的發展進程，是OSCC治療的潛在靶點。

circRNA可作為競爭性內源RNA（ceRNA）的組成部分，抑制miRNA的活性，從而調控靶基因轉錄、翻譯等功能[11]。生物信息學軟件預測顯示，circ_0005379可能是miR-17-5p的海綿，通過吸附miR-17-5p調控其表達。研究[12-14]顯示，miR-17-5p在結直腸癌、鼻咽癌、多發性骨髓瘤等腫瘤中表達升高，下調其表達可抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為。為了進一步探討過表達circ_0005379發揮抗OSCC作用的機制，本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗和RNA免疫共沉淀實驗證實了circ_0005379在OSCC細胞中可與miR-17-5p結合，且過表達circ_0005379后，OSCC細胞中miR-17-5p表達水平降低，說明circ_0005379可吸附miR-17-5p并下調其表達，這也與circ_0005379在OSCC組織和細胞中呈低表達，而miR-17-5p呈高表達的結果一致。本研究還顯示，過表達miR-17-5p可逆轉過表達circ_0005379對OSCC細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡誘導作用，提示過表達circ_0005379通過下調細胞中miR-17-5p表達來發揮抗OSCC作用。

ACOX1參與脂肪酸氧化，是過氧化物酶體脂肪酸-β氧化第一步脫氫反應的限速酶。研究[15-16]已表明，ACOX1在乳腺癌和胰腺導管腺癌等腫瘤中表達降低，參與腫瘤發生發展。本研究顯示，OSCC組織和細胞系中ACOX1呈低表達，提示ACOX1可能作為抑癌基因參與該疾病的發生發展。生物信息學軟件預測顯示，ACOX1可能是miR-17-5p的靶基因。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗和RNA免疫共沉淀實驗證實了miR-17-5p可與ACOX1靶向結合。此外，過表達miR-17-5p可降低OSCC細胞中ACOX1蛋白表達，證實了miR-17-5p靶向負調控ACOX1表達。本研究還顯示，沉默circ_0005379表達可降低OSCC細胞中ACOX1蛋白表達，進一步說明circ_0005379通過競爭性吸附miR-17-5p上調ACOX1表達來抑制OSCC細胞惡性生物學行為，發揮抗OSCC作用。通過皮下注射穩定過表達circ_0005379的OSCC細胞建立裸鼠移植瘤模型，結果顯示，過表達circ_0005379可抑制裸鼠腫瘤生長，且腫瘤組織中miR-17-5p表達水平降低，而ACOX1蛋白表達水平升高，提示circ_0005379通過吸附miR-17-5p而上調ACOX1表達抑制裸鼠腫瘤生長。

綜上所述，circ_0005379在OSCC組織和細胞中呈低表達，其可能通過競爭性吸附miR-17-5p進而促進ACOX1表達來降低OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡及抑制腫瘤生長，其可能是OSCC治療的分子靶點。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。