人釉原蛋白全長及其功能片段的體外自組裝和礦化行為的研究

鐘秀 賴婷婷 陳亮 田鯤

1.西南醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，瀘州646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院口腔科，成都610072；3.遵義醫(yī)學(xué)院，遵義563000

釉質(zhì)覆蓋在牙冠表面，作為人體最堅硬的組織具有強大的機械性能，但一經(jīng)損傷不能再生。因此，釉質(zhì)的仿生修復(fù)具有重要的科學(xué)價值和治療需求。釉質(zhì)發(fā)育的礦化過程由成釉細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白持續(xù)介導(dǎo)，其中釉原蛋白（amelogenin，AM）及其裂解產(chǎn)物占90%以上[1]。AM主要由含45個氨基酸的N端酪氨酸富集段（tyrosinerich amelogenin peptide，TRAP）、X-Y-脯氨酸重復(fù)序列組成的疏水性中央?yún)^(qū)域、相對較短含11個氨基酸的親水性帶電荷C末端3部分組成[2]，其中親水性C末端以及疏水性N末端高度保守，具有重要的生理學(xué)相關(guān)性，在釉質(zhì)發(fā)生中發(fā)揮作用。

N末端主要影響AM的自組裝并調(diào)節(jié)蛋白間的相互作用[3]。蛋白水解的N末端裂解形成較小的TRAP功能肽，參與了釉基質(zhì)蛋白的相互作用過程，為組裝中的各種釉基質(zhì)蛋白提供分子連接位點[4]。亮氨酸富集段（leucine-rich amelogenin peptide，LRAP）由AM的26個C-末端氨基酸和33個N-末端氨基酸構(gòu)成，包含了AM完整的帶電C末端。LRAP主要影響對無機晶體的吸附，能穩(wěn)定無定形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，ACP），調(diào)節(jié)其晶體平行排列，引導(dǎo)ACP轉(zhuǎn)化為有序的束狀磷灰石晶體[5]。LRAP還能指導(dǎo)成釉細(xì)胞、骨細(xì)胞的分化[6]，促進(jìn)牙周組織的再生[7]等。

AM在釉質(zhì)礦化過程中具有無法替代的地位，體外“仿生礦化模板”對AM及其功能片段的模仿程度越高，引導(dǎo)生成的羥磷灰石（hydroxyapatite，HA）晶體排列就越接近天然牙釉質(zhì)，使得AM及其功能片段在體外誘導(dǎo)釉質(zhì)再生領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前關(guān)于AM功能片段LRAP及TRAP的單獨研究較少，且大多使用動物蛋白，如鼠、豬等。因此本實驗重組表達(dá)了人AM及功能片段LRAP和TRAP，觀察比較其自組裝過程，探尋其從單分子克隆到礦化骨架的組合變遷。并在不同時間點添加AM、LRAP及TRAP以模擬體內(nèi)蛋白作用順序，觀察不同時間段HA晶體的形成特點，旨在探討AM和功能片段LRAP和TRAP在釉質(zhì)發(fā)生及HA晶體各向生長過程中的可能機制，為釉質(zhì)仿生修復(fù)治療提供更多的參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

選取正畸患者預(yù)防性拔除的處在釉質(zhì)發(fā)育階段的下頜第三磨牙牙胚（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院齒槽外科），全部取樣均取得患者及其監(jiān)護(hù)人同意。Trizol RNA分離試劑、質(zhì)粒提取試劑盒（上海賽默飛世爾科技有限公司），pMD19-T載體（大連寶生物工程有限公司），pET-28a（+）載體、BL21（DE3）Chaprone感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞（四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院人類疾病基因研究四川省重點實驗室），大腸桿菌BL21plys（北京全式金生物技術(shù)有限公司），pCold-SUMO載體、Ni-NTA純化樹脂（杭州海基生物科技有限公司），4-羥乙基哌嗪乙磺酸（N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonicacid，HEPES）緩沖液、MgCl2、CaCl2·H2O、KH2PO4、KCl、NH4Cl、NaF（杭州眾化科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 AM全長的合成 從處于釉質(zhì)發(fā)育階段的兒童下頜第三磨牙的牙胚中提取牙胚細(xì)胞總RNA，設(shè)計AM全長上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGGGGACCTGGATTTT-3’，下游引物序列為5’-CGAGCTCTTAATCCACTTCCTCCCGC-3’。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增得到AM全長的cDNA，與pMD19-T載體進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建后轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10中擴(kuò)增，篩選與鑒定后得到AM全長基因。AM全長基因與原核表達(dá)載體pET-28a（+）進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，將重組質(zhì)粒進(jìn)行篩選和鑒定后用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21plys中，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）檢測，純化，得到AM全長。

1.2.2 LRAP和TRAP片段的合成 用以上AM全長基因做模板，設(shè)計LRAP上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGCCTCTACCACCTCATCCT-3’，下游引物序列為5’-CGAGCTCTTAATCCACTTCCTCCCGCTTG-3’；TRAP上游引物序列為5’-CGCGGATCCATGCCTCTACCACCTCATCCT-3’，下游引物序列為5’-CGAGCTCTTACCATCCACCCATGGGC-3’。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增構(gòu)建LRAP、TRAP基因，克隆后測序鑒定。將LRAP、TRAP基因分別和pCold-SUMO原核表達(dá)載體進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建，鑒定后轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）Chaprone宿主菌中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE驗證，rTEV酶切后Ni-NTA純化樹脂純化，得到LRAP、TRAP蛋白。

1.2.3 自組裝實驗 在50×三氯基甲烷（Tris-HCl，pH=8）中分別加入純化的AM全長、LRAP、TRAP蛋白儲備液（2 mg·mL-1），調(diào)節(jié)pH至8，最后再添加適量50×Tris-HCl（pH=8），在冰上建立最終的蛋白質(zhì)溶液，濃度為100μg·mL-1。用毛細(xì)吸管吸取各蛋白溶液滴至銅網(wǎng)多孔碳側(cè)，在室溫下孵育1～15 min，分別在1、15 min時夾取銅網(wǎng)，濾紙吸去多余溶液，1%過濾磷酸-鎢酸負(fù)染30 s，濾紙吸去染液，室溫干燥后透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察其自組裝過程。

1.2.4 體外礦化實驗 配制人工唾液，在20 mmol·L-1HEPES緩沖液中加入一定量的CaCl2·H2O（1 mmol·L-1）、MgCl2（0.2 mmol·L-1）、KH2PO4（4 mmol·L-1）、KCl（16 mmol·L-1）和NH4Cl（4.5 mmol·L-1），調(diào)節(jié)pH至8，使用前加入NaF（3×10-4）。在玻片上滴加2 mL人工唾液，滴入AM蛋白儲備液至AM蛋白濃度為100μg·mL-1，孵育3 d后掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）觀察新生晶體形貌；再滴入等量TRAP、LRAP蛋白儲備液至TRAP、LRAP蛋白濃度為100μg·mL-1，繼續(xù)孵育3 d，SEM再次觀察新生晶體形貌。

1.2.5 X射線衍射分析 采用DMAX-3A型X射線多晶衍射儀對礦化6 d的新生晶體進(jìn)行分析，工作條件為：CuKα射線，電壓70 kV，電流50 mA，衍射起始角10°，衍射終止角80°，步長0.02°。

2 結(jié)果

2.1 AM全長及LRAP、TRAP的合成和鑒定

PCR擴(kuò)增構(gòu)建的AM全長、LRAP、TRAP基因經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，可分別見570、230、130 bp的特異性條帶，與AM全長、LRAP、TRAP基因理論大小基本相符（圖1）。對獲得的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE后，可分別見大小23 000、5 000、6 000的條帶，與AM全長、LRAP及TRAP的理論相對分子質(zhì)量基本符合，表明成功重組并表達(dá)了AM全長、LRAP及TRAP蛋白（圖2）。

圖1 AM全長及LRAP、TRAP基因的重組Fig 1 Recombination of AM,LRAPand TRAPgenes

圖2 AM全長及LRAP、TRAP的SDS-PAGE圖譜Fig 2 SDS-PAGEof AM,LRAPand TRAP

2.2 AM全長的自組裝結(jié)果

蛋白液孵育1 min時，溶液中的AM全長大部分以單體形式存在，單體直徑為1～2 nm。繼續(xù)孵育15 min時，蛋白單體自組裝形成了直徑20～30 nm的“納米球”。這些納米球進(jìn)一步聚集，可見3個納米球成角串起形成的“三角形”結(jié)構(gòu)，數(shù)個納米球排列形成的“串珠樣”結(jié)構(gòu)以及多個納米球聚集形成的有進(jìn)一步排列成鏈狀、網(wǎng)狀趨勢的不規(guī)則結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)AM全長的分級自組裝（圖3）。

圖3 AM全長自組裝的觀察結(jié)果Fig 3 Micrographs of full-length AM self-assembly

2.3 LRAP的自組裝結(jié)果

LRAP蛋白溶液在孵育1 min時，溶液中的LRAP蛋白多以單體形式存在，孵育15 min后TEM下仍不能明顯觀察到LRAP蛋白自組裝形成的納米球及中間結(jié)構(gòu)，溶液中的蛋白優(yōu)勢形態(tài)為無結(jié)構(gòu)的單體形態(tài)，也可見少量低聚物（圖4）。

圖4 LRAP自組裝的觀察結(jié)果 TEM ×500 000Fig 4 Micrographs of LRAP self-assembly TEM ×500 000

2.4 TRAP的自組裝結(jié)果

TRAP蛋白溶液在孵育1 min時，溶液中僅見蛋白單體。孵育15 min后，溶液中可見明顯的直徑20～50 nm的納米小球。TRAP蛋白形成的納米球形狀十分規(guī)則，呈均勻的圓球形，沒有明顯的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，外周有月暈狀的黑色光圈，且納米小球的直徑越大，其外周的光圈越明顯。TRAP蛋白由單體到納米球的形成中無分級組裝過程，且組裝形成的納米小球之間無進(jìn)一步聚集的趨勢，相互之間孤立存在（圖5）。

圖5 TRAP自組裝的觀察結(jié)果

2.5 體外礦化實驗結(jié)果

AM在人工唾液中孵育3 d后，可見其引導(dǎo)的新生晶體呈細(xì)長棒狀，沿c軸取向，直徑55～60 nm，平均長度800 nm，數(shù)個晶體相互呈一定角度捆綁形成直徑220 nm的晶體束。加入TRAP、LRAP孵育3 d后，新生晶體在a、b面生長欠佳，直徑無明顯變化（60～65 nm），而在c軸上顯著伸長（1 200 nm）；晶體較AM單獨誘導(dǎo)數(shù)量更多、取向更佳，形成直徑為500 nm的晶體束，絕大部分細(xì)長棒狀晶體有序近似平行排列，僅有晶體束最外層的少量晶體與晶體束長軸成較大角度排列（圖6）。

圖6 不同時間點加入相應(yīng)蛋白誘導(dǎo)生成的晶體Fig 6 The crystals induced by the corresponding proteins were added at different time

2.6 X射線衍射分析結(jié)果

X射線衍射圖譜在2θ衍射角為25.8°、32°、32.2°和32.9°處出現(xiàn)強度不同的衍射峰，分別與HA晶體（002）、（211）、（112）、（300）面的特征峰一致，表明AM及TRAP、LRAP誘導(dǎo)新生的晶體為HA晶體（圖7）。

圖7 新生晶體的X射線衍射圖Fig 7 XRD pattern of thenewborn crystal

3 討論

成熟釉質(zhì)主要由HA晶體組成，這些晶體平行排列，形成釉柱，而釉柱又定向排列成高度有序的釉質(zhì)結(jié)構(gòu)。釉質(zhì)中的HA晶體非常狹長、呈六方棱柱形，在c軸方向延長，表觀長度一般為250～1 000 nm，寬 度 為60～100 nm，厚 度 為26.3～35.0 nm。與天然HA晶體一樣，釉質(zhì)中的HA晶體由六面晶體的晶胞組成，晶胞六邊形邊長為0.943 2 nm，長度為0.688 nm[8]。

成釉細(xì)胞在分泌期合成的有機基質(zhì)可分為AM和非釉原蛋白兩類，其中AM占90%以上。發(fā)育中天然牙的釉質(zhì)基質(zhì)里，AM及其酶解產(chǎn)物融合成較大尺寸的納米結(jié)構(gòu)而發(fā)揮作用，在釉質(zhì)成熟后則基本消失。AM分泌到釉基質(zhì)中很快被裂解，在分泌早期，基質(zhì)金屬蛋白酶-20（matrix metalloproteinase-20，MMP-20）在有限且相同的位點裂解或加工全長AM，產(chǎn)生富含酪氨酸的TRAP、相對分子質(zhì)量為23 000的中間肽段和不同的C末端片段；而在成熟期，激肽釋放酶4（kallikrein4，KLK4）會特異性地將MMP-20處理后的釉基質(zhì)蛋白降解為更小的多肽，被成釉細(xì)胞徹底吸收，無機物含量能達(dá)到95%，控制著釉質(zhì)的賦形和礦化率[9]。

在體外，AM在pH=8和37℃環(huán)境中，N端疏水的脯氨酸富集區(qū)域相互聚攏，C端親水的帶電荷氨基酸尾巴TLAGGVA朝向外，形成直徑20 nm的球狀納米自組裝體，然后納米小球多向延伸，組裝成納米鏈和納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[10]，與本實驗結(jié)果相符。而本實驗結(jié)果表明：TRAP片段形成沒有親水氨基酸尾巴的納米微球，且納米球之間沒有相互進(jìn)一步聚集成鏈狀、網(wǎng)狀的趨勢；LRAP片段則一直處于無結(jié)構(gòu)的單體形態(tài)；AM單獨誘導(dǎo)3 d后形成棒狀HA晶體，再加入TRAP、LRAP蛋白誘導(dǎo)3 d后，HA晶體在c軸方向快速擇優(yōu)生長，而a、b平面生長被抑制，且晶體取向更優(yōu)。在磷酸八鈣晶體（octalcium phosphate，OCP）的生長實驗中，AM的疏水部分在控制晶體形狀方面起作用，最有可能是通過在a、b晶體平面上的選擇性吸附來抑制a、b平面的生長，這一抑制過程與C端區(qū)域無關(guān)，而帶負(fù)電荷親水的C端區(qū)域能通過Glu和Asp殘基側(cè)鏈羧基之間的金屬離子螯合作用調(diào)節(jié)OCP晶體沿c軸方向相互平行排列[11]，與本實驗結(jié)果相符。

結(jié)合本實驗的結(jié)果及HA晶體的生長過程來看，可能的機制是，在釉質(zhì)礦化的生長基元形成期，AM分級自組裝形成球形超分子結(jié)構(gòu)，COOH-端親水尾部基團(tuán)與鈣離子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，啟動礦化過程，納米球開始HA成核然后繼續(xù)和釉原蛋白COOH-端的負(fù)電基團(tuán)緊密結(jié)合。由于HA晶體表面電荷分布的空間匹配，納米球聚集在其周圍沿著晶體的c軸包裹晶體，組裝成納米長鏈，這種長鏈結(jié)構(gòu)為晶體的成核和c軸方向生長提供有序模板，并阻止a、b晶面融合生長趨勢。隨后在生長基元疊合期，MMP-20選擇性降解AM，形成一些功能小分子蛋白片段，其中疏水性的TRAP及中間肽段組裝成納米微球，包覆a、b軸面，因其負(fù)電性及親水性均減弱，屏蔽了HA晶體a、b軸向的晶面結(jié)合位點。與此同時，c軸上成核位點暴露，鈣磷鹽不斷沉積，晶體迅速沿著c軸擇優(yōu)生長，在親水帶負(fù)電LRAP的調(diào)節(jié)下相互平行排列。最后，在KLK4的作用下，大部分蛋白降解后被成釉細(xì)胞徹底消化，蛋白與HA晶體的結(jié)合降低，對a、b軸面的包覆作用減弱，成核位點暴露，晶體得以沿著a、b軸方向生長、變粗，最終成熟。

許多研究已經(jīng)實現(xiàn)了AM促進(jìn)釉質(zhì)形成的過程，并肯定AM的重要作用，但AM全長及其被降解的功能片段完成一系列引導(dǎo)HA晶體不同時機不同軸向生長的具體機制還未完全清楚。本實驗對比了AM全長、TRAP和LRAP的自組裝行為，并根據(jù)以上蛋白多肽在釉質(zhì)發(fā)育過程中的大致作用時間順序設(shè)計體外礦化實驗，結(jié)果表明：AM全長分級自組裝形成直徑20～30 nm的“納米球”后有進(jìn)一步多向延伸組裝成鏈狀、網(wǎng)狀趨勢；疏水的TRAP組裝成直徑20～50 nm的孤立納米球，無分級組裝過程；而LRAP自組裝行為不明顯，多以無定形單體形式存在；AM在體外單獨誘導(dǎo)可形成細(xì)長的棒狀HA晶體，繼續(xù)加入TRAP、LRAP蛋白后HA晶體在c軸明顯延長，而a、b平面生長欠佳，且晶體取向更優(yōu)。本實驗結(jié)果與體內(nèi)HA晶體定向生長的機制契合，為它們在HA晶體形成過程中的作用提供了理論依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。