白皮杉醇抗惡性黑色素瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究

余波 劉偉 胡敏琪 唐休發(fā) 李春潔 闕林

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科，成都610041

惡性黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞且惡性程度極高的腫瘤，早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]，從全球數(shù)據(jù)來看，盡管其發(fā)病數(shù)僅占皮膚惡性腫瘤總數(shù)的5%，死亡例數(shù)卻占皮膚癌的大部分[2]。其可發(fā)生于皮膚、黏膜、內(nèi)臟等部位，特別是四肢極易摩擦部位[3]。目前，惡性黑色素瘤已經(jīng)成為世界上發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，年增長率為3%～5%，我國每年新發(fā)病例約為2萬例，惡性黑色素瘤患者死亡與新發(fā)病例的比例明顯高于全球平均水平[4]。2020年，美國預(yù)計(jì)新增皮膚黑色素瘤100 350例，新增死亡6 850例[5]。對于美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期中0期、IA期、IB期的早期惡性黑色素瘤，首選的治療方式依然為手術(shù)切除，選擇做有足夠安全范圍的切除，可使患者具有良好的預(yù)后[6]。但是對于手術(shù)無法切除，或者發(fā)生多處轉(zhuǎn)移而切除效果欠佳的晚期患者，則預(yù)后極差[7]，然而隨著免疫治療及靶向治療的發(fā)展，比如常用的達(dá)拉菲尼聯(lián)合曲美替尼針對具有BRAF V600E突變的病例[8]，伊馬替尼針對具有KIT突變的病例[9]，抗細(xì)胞毒性T細(xì)胞淋巴細(xì)胞抗原4（ytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）及抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）抗體均取得了良好的效果[6,10]，其預(yù)后得到了一定的改善。有報(bào)道[11]稱有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者其中位生存期為6～12個(gè)月，5年生存率為5%，而另有報(bào)道[12]發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的中位生存期可達(dá)24個(gè)月。但是24個(gè)月的中位生存期并不能讓人完全滿意。另外多種藥物只對相應(yīng)的類型發(fā)揮效果，不能對所有惡性黑色素瘤產(chǎn)生治療效果，如口腔惡性黑色素瘤[13]。再有該類治療伴有不同程度的不良反應(yīng)[14-15]，所以期望探索更多的治療方式。

白皮杉醇（piceatannol，PIC）是白藜蘆醇的類似物和代謝產(chǎn)物，是一種常見的天然二苯乙烯，廣泛存在于葡萄、甘蔗、百香果、越橘屬漿果、大黃、桂皮和大戟屬植物等多種水果和植物中的化合物[16]，具有多種生物學(xué)功能[17]。近年來，PIC在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力等方面的作用越來越多地受到關(guān)注[18]。根據(jù)Du等[19]的研究，PIC可以促進(jìn)miR-181a的表達(dá)，miR-181a通過抑制黑色素瘤細(xì)胞中的Bcl-2介導(dǎo)了促凋亡作用，提示PIC可能是治療黑色素瘤的有效藥物。但該研究并未對PIC是否對黑色素瘤其他功能具有作用及可能機(jī)制做進(jìn)一步探討。另一方面，PIC作為脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）的選擇性抑制劑，能有效抑制Syk的磷酸化而發(fā)揮各種生物學(xué)作用，這可能也是PIC發(fā)揮腫瘤抑制功能的機(jī)制。故本實(shí)驗(yàn)擬通過體內(nèi)外研究對PIC是否能抑制惡性黑色素瘤的其他功能以及其可能作用機(jī)制進(jìn)行探究。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6小鼠（成都達(dá)碩生物科技有限公司），實(shí)驗(yàn)經(jīng)過四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（倫理號：WCHSIRB-D-2017-77），實(shí)驗(yàn)過程對動物的處置符合倫理學(xué)要求。

1.1.2 材料、器材和試劑 惡性黑色素瘤細(xì)胞系B16F10（由四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。10%胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、OPTI-MEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)公司），兔抗鼠Syk抗體、兔抗鼠磷酸化Syk抗體、兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫 酶 （glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Affinity公司，美國），兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2抗體、兔抗鼠MMP-9抗體、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（Santa Cruz公司，美國），羊抗兔二抗（SAB公司，美國），PIC（Selleck公司，美國），預(yù)染蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)液、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司，美國），PureLink?RNA小量試劑盒（Life Technologies公司，日本），實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）試劑盒（TAKARA公司，日本），聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（PALL公司，美國），CFX96實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測系統(tǒng)（Biorad公司，美國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

培養(yǎng)惡性黑色素瘤細(xì)胞系B16F10細(xì)胞時(shí)使用含有10%胎牛血清、雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。細(xì)胞每隔2～3 d進(jìn)行傳代，選擇處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)佳的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。為了檢查沉默Syk后B16F10細(xì)胞的侵襲及遷移能力，分組為：以siRNA-Syk轉(zhuǎn)染細(xì)胞做siRNA實(shí)驗(yàn)組，NC作為對照組；為檢查PIC對B16F10細(xì)胞活力的影響，以PIC溶于DMSO配置為濃度0、20、40、60、80、100μmol·L-1的溶液處理細(xì)胞做抑制劑實(shí)驗(yàn)組，以DMSO處理細(xì)胞作為對照組；為了檢查PIC處理對B16F10細(xì)胞侵襲及遷移功能的影響及MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)變化，以PIC溶于DMSO配置為濃度10、20、30μmol·L-1的溶液處理細(xì)胞做抑制劑實(shí)驗(yàn)組，以DMSO處理細(xì)胞作為對照組。

1.3 小干擾RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞

針對Syk基因序列設(shè)計(jì)siRNA。siRNA-Syk序列為5’-GAACUGGGCUCUGGUAAUU-3’，siRNA-NC為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔5×105個(gè)B16F10細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)配置A液將2×10-11mol siRNA溶于50μL OPTIMEM無血清培養(yǎng)基制成；B液將1μL Lipofectamine 2000溶于50μLOPTI-MEM無血清培養(yǎng)基，混勻室溫靜置5 min制成；將A、B混合為C，靜置20 min；將C加入對應(yīng)孔中。

1.4 蛋白印跡法測定蛋白表達(dá)水平

首先提取細(xì)胞蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量檢測。蛋白樣品中加入5×上樣緩沖液，在100℃煮沸5 min。各上樣孔加40μg蛋白樣品，以10%的分離膠、5%的濃縮膠，在90 V恒壓條件下電泳，染料移動到電泳槽的底部時(shí)停止電泳。200 mA置于冰浴中轉(zhuǎn)膜1.5 h。把膜放在5%牛血清白蛋白中封閉1 h。PVDF膜放在一抗（MMP-2、MMP-9、VEGF、Syk、p-Syk抗體以5%BSA稀釋）中，置于4℃孵育過夜。取出PVDF膜，TBST洗膜，二抗室溫孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光攝取圖像。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞活力

將各組細(xì)胞以每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)復(fù)孔5個(gè)，每孔加入細(xì)胞懸液100μL。第2日加入相應(yīng)刺激。37℃培養(yǎng)24 h。每孔加入20μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在570 nm處測量各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.6 RT-qPCR

PureLink?RNA小量試劑盒提取細(xì)胞mRNA，分光光度法測定RNA濃度后調(diào)平濃度，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用CFX96實(shí)時(shí)定量PCR檢測系統(tǒng)檢測mRNA的表達(dá)量。引物由日本Life Technologies公司合成。Syk上游引物序列：5’-ACTTGGTCAGCGGGTGGAAT-3’，下游引物序列：5’-GGGTGCAAGTTCTGGCTCAT-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列：5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。最后，用2-ΔΔCT統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析結(jié)果。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

將各組細(xì)胞（每孔5×105個(gè)細(xì)胞）接種在6孔板上。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，用200μL槍頭垂直背部橫線劃痕。然后用PBS洗3次，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于劃痕的0、8 h觀察并拍照測定細(xì)胞遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

檢測各組細(xì)胞的侵襲能力。PBS清洗后使用胰酶消化細(xì)胞，離心棄去培養(yǎng)液，再使用無血清含1%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基制備為細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于自帶凝膠化Matrigel基質(zhì)的上室，下室加入全營養(yǎng)DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，抹去上室膜上表面細(xì)胞及Matrigel凝膠后，置于4℃冷室，用-20℃保存的甲醇固定10 min，吸棄固定液后，室溫下0.5%結(jié)晶紫染色，雙蒸水洗滌，顯微鏡下拍照，計(jì)數(shù)。

1.9 荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)

PBS清洗后使用胰酶消化B16F10細(xì)胞，置于冰上降低細(xì)胞代謝。選擇生長狀態(tài)良好，體重18～20 g的C57BL/6小鼠，小心剃去背部靠后毛發(fā)。將含2×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液注射入皮下。繼續(xù)飼養(yǎng)并在第4、7、10天均分別以濃度為0、10、20、40 mg·kg-1腹腔注射PIC，在第5、8、11、14天測量并計(jì)算腫瘤體積，第14天處死小鼠取出瘤體進(jìn)行測量。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，各組之間的比較使用方差分析進(jìn)行，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PIC抑制B16F10的增殖、遷移及侵襲能力

對B16F10細(xì)胞使用濃度為0、20、40、60、80、100μmol·L-1的PIC溶液進(jìn)行處理，經(jīng)過MTT實(shí)驗(yàn)顯示其細(xì)胞活力隨濃度升高而降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；Western blot結(jié)果顯示PIC能夠顯著阻礙Syk的激活，PIC處理后B16-F10細(xì)胞的MMP-2、MMP-9、VEGF表達(dá)減少，且減少量與濃度呈正相關(guān)；劃痕實(shí)驗(yàn)表明，PIC處理后細(xì)胞的遷移能力隨PIC濃度升高而逐漸減弱，Transwell實(shí)驗(yàn)證明其侵襲能力也逐漸減弱（圖1）。

圖1 PIC處理使B16F10細(xì)胞活力、遷移侵襲能力下降Fig 1 Treating with PICdecreased theviability,migration and invasion of B16F10 cells

2.2 沉默Syk使B16F10細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力下降

si-Syk處理B16F10細(xì)胞，PCR驗(yàn)證了所選擇的siRNA能夠有效降低Syk的表達(dá)。MTT實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)si-Syk處理后的B16F10細(xì)胞增殖受到抑制，Western blot實(shí)驗(yàn)表明si-Syk組細(xì)胞中與腫瘤侵襲功能相關(guān)的MMP-2、MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)量較NC組下降，劃痕實(shí)驗(yàn)表明si-Syk組細(xì)胞遷移能力較NC組減弱（圖2）。

圖2 小干擾RNA沉默Syk使B16F10細(xì)胞活力、遷移侵襲能力下降Fig 2 Silencing Syk by siRNA decreased theviability,migration and invasion of B16F10 cells

2.3 PIC抑制B16F10在小鼠體內(nèi)成瘤能力

經(jīng)過B16F10皮下注射構(gòu)建荷瘤小鼠，在0、10、20、40 mg·kg-1腹腔注射PIC后，其腫瘤進(jìn)展受到顯著抑制并且存在明顯的劑量依賴作用（圖3）。

圖3 梯度濃度PIC處理小鼠對皮下成瘤的影響Fig 3 Effect of gradient concentration of PICon subcutaneoustumorigenesisin mice

3 討論

惡性黑色素瘤是一種惡性程度極高的腫瘤，近年來，其發(fā)病率及死亡率逐漸增加，并呈年輕化趨勢[20]。晚期惡性黑色素瘤的治療有了更多的選擇[21]。但是考慮到各種治療的局限性[22]，應(yīng)該積極探索新的藥物及其作用機(jī)制。

PIC作為一種天然小分子化合物，擁有多種生物活性，已經(jīng)被證實(shí)對多種腫瘤細(xì)胞，如前列腺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、口腔鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲有一定的抑制作用[19,23]。本研究中，MTT檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)PIC能抑制B16F10細(xì)胞活力；劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)PIC能夠抑制B16F10細(xì)胞遷移、侵襲能力，且強(qiáng)度與PIC濃度呈正相關(guān)。PIC處理后細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、VEGF表達(dá)降低，且與PIC濃度呈正相關(guān)。MMP-2、MMP-9是一類蛋白水解酶，它們可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的多種成分，允許腫瘤擴(kuò)散，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[24]；VEGF則是具有促血管生成活性的生長因子，對內(nèi)皮細(xì)胞具有促有絲分裂和抗凋亡作用，可以增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞遷移[25]。

為了探究PIC作用的可能機(jī)制，首先通過Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PIC處理的B16F10細(xì)胞內(nèi)Syk蛋白表達(dá)水平下降，且磷酸化明顯減少，驗(yàn)證了PIC對Syk的抑制作用。既往研究[26]認(rèn)為，Syk主要在免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)揮作用，是炎癥反應(yīng)中的重要分子。但是近年來發(fā)現(xiàn)了它的其他生物學(xué)功能，比如細(xì)胞黏附、免疫識別等。此外，又逐漸發(fā)現(xiàn)其在在不同類型的腫瘤中顯示出促癌與抑癌兩方面功能。通過RNA干擾沉默Syk后發(fā)現(xiàn)B16F10細(xì)胞的活力下降，遷移能力減弱，與細(xì)胞侵襲遷移功能相關(guān)的功能蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)也相應(yīng)的下降。這說明Syk在惡性黑色素瘤細(xì)胞的發(fā)展中起到促癌的作用。PIC可抑制Syk而對惡性黑色素瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用。

為進(jìn)一步研究PIC是否能在體內(nèi)環(huán)境抑制惡性黑色素瘤，對小鼠腹腔注射B16F10細(xì)胞，從而成功構(gòu)建了小鼠荷瘤模型，而后以PIC多次給藥模擬給藥過程。結(jié)果小鼠成瘤體積與PIC給藥濃度呈負(fù)相關(guān)，這說明PIC對體內(nèi)的腫瘤有抑制作用。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PIC能夠在體外抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞的遷移、侵襲等功能，在體內(nèi)抑制惡性黑色素瘤的生長。PIC可能成為治療皮膚惡性黑色素瘤的一種新選擇。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。