CXC亞家族趨化因子配體10-受體3/CC亞家族趨化因子配體17-受體4軸在口腔扁平苔蘚發病機制中的交互作用

唐楠 張雨垚 程玨華 趙知白 范媛

南京醫科大學附屬口腔醫院口腔黏膜病科，江蘇省口腔疾病研究重點實驗室，江蘇省口腔轉化醫學工程研究中心，南京210029

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是一種慢性炎癥性口腔黏膜病，其病理特征是固有層密集淋巴細胞呈帶狀浸潤，基底層液化變性[1-3]。OLP是一種T淋巴細胞介導的局部自身免疫性疾病[4]，雖然病因尚不清，但細胞免疫因素在發病機制中起著關鍵作用[5]。目前明確趨化因子與趨化因子受體結合可以調節抗原提呈、細胞因子產生以及效應T細胞和記憶T細胞的分化[6]，且二者在正常組織和炎癥組織中決定免疫細胞和炎性介質轉運方面存在差異表達[4]。

CXC亞家族趨化因子受體（CXC chemokine receptor，CXCR）3可與CXC亞家族趨化因子配體（CXCchemokine ligand，CXCL）9/10/11結合，介導輔助性T細胞（helper T cell，Th）1型疾病的發生[7]，如自身免疫性疾病[8]、超敏反應及界面皮炎等[7,9]。CC亞家族趨化因子受體（CC chemokine receptor，CCR）4是CC亞家族趨化因子配體（CC chemokine ligand，CCL）17和22的受體，主要調節Th2細胞相關的免疫過程如多發性硬化癥（multiplesclerosis，MS）[10]。課題組[11-12]前期對CXCL10-CXCR3、CCL17-CCR4兩個軸分別進行了研究，發現在OLP中兩軸相關受體/配體均存在異常表達，但兩軸間的相關互作關系尚不明確。故本研究通過收集OLP及健康者外周血對T淋巴細胞交叉干擾，檢測兩軸相關受體/配體的表達水平，進一步探討兩軸間的相互關系，從而為進一步闡明趨化因子及受體在OLP發病機制中的網絡調控作用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑

磁珠、流式管、流式細胞檢測儀（BD公司，美國），淋巴細胞分離液、EasySepTM人CD3陽性細胞分選試劑盒（Stemcell公司，加拿大），磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、RPMI 1640培養基、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Gibco公司，美國），CXCR3（MCE公司，美國），CCR4拮抗劑（RD公司，美國），PE熒光標記的抗人CD3抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）熒光標記的抗人CD4抗體、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）熒光標記的抗人CD183（CXCR3）抗體、APC熒光標記的抗人CD194（CCR4）抗體；PE熒光標記的小鼠抗人CXCR3免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G1抗體和別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）熒光標記的小鼠抗人IgG1抗體（Biolegend公司，美國），人趨化因子配體10、17雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（杭州市聯科生物技術股份有限公司）。

1.2 試驗樣本

本研究招募2019年1—9月就診于江蘇省南京醫科大學附屬口腔醫院口腔黏膜病科的受試者，40名OLP患者作為試驗組，其中男16例，女24例，年齡（44.880±1.195）歲，20名健康者為對照組，其中男7例，女13例，年齡（44.500±2.516）歲。依據第4版《口腔黏膜病學》教科書、世界衛生組織和van der Meij等[13]提出的準則，根據OLP病損基部黏膜狀況分型，分為糜爛型和非糜爛型各20例，其中糜爛型男7例，女13例，平均年齡（46.300±1.608）歲；非糜爛型男9例，女11例，平均年齡（43.450±1.749）歲。糜爛型為除白色病損外，線紋間及病損周圍黏膜發生充血、糜爛、潰瘍；非糜爛型為白色線紋間及病損周圍黏膜正常，無充血、糜爛，黏膜上白色、灰白色線狀花紋組成網狀、環狀、斑塊、水皰多種病損。試驗組與對照組的性別和年齡差異無統計學意義，所有受試者的年齡范圍均在18～70歲之間。OLP患者的病程為1個月～1年不等，臨床和組織病理學診斷標準符合世界衛生組織和van der Meij等[13]提出的準則。排除標準：1）患其他已確定的口腔黏膜疾病；2）有較嚴重的系統性疾病、腫瘤；3）1個月內使用過抗生素、3個月內使用過免疫制劑；4）某些藥物或銀汞合金充填物可能引起苔蘚樣反應；5）嚴重嗜煙、嗜酒。健康受試者納入條件為無全身疾病、無口腔黏膜病、3個月內未服用抗生素、免疫抑制劑[13-14]。該研究獲南京醫科大學倫理學委員會批準，批準號：南醫大倫審（2014）132號。

1.3 外周血T細胞分離和鑒定

將收集的靜脈血密度梯度離心分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），離心后PBS洗2次棄上清液，抗CD3抗體包被、CD3磁珠分選T細胞，選取一定量細胞加入PE標記的抗人CD3流式抗體，4℃避光環境下孵育30 min，并設置未加抗體的細胞混懸液為陰性對照組，流式細胞儀上機檢測，然后剩余細胞放于37℃、5%CO2細胞培養箱中孵育。

1.4 拮抗劑與T細胞共培養

取出細胞，1 000 r·min-1、4 min離心后棄上清，記錄細胞數，加入T細胞培養液并等量分至24孔板的3孔中，分別為空白組（不加拮抗劑）、拮抗CXCR3組（加入CXCR3拮抗劑）、拮抗CCR4組（加入CCR4拮抗劑）。最后將細胞置于37℃、5%CO2培養箱中孵育。

1.5 流式細胞術實驗

取出培養的細胞離心并將上清液留存至-80℃冰箱中，待后續生物素雙抗體夾心ELISA實驗使用。PBS洗滌流式管2次并設置空白、拮抗CXCR3、拮抗CCR4三組各自的同型對照組。6個流式管中均加入FITC熒光標記的抗人CD4流式抗體，得以分選出Th細胞。試驗組分別加入PE標記的抗人抗體CXCR3和APC標記的抗人抗體CCR4；同型對照組3管中分別加入PE標記的小鼠抗人CXCR3 IgG1抗體和APC標記的小鼠抗人IgG1抗體。4℃避光環境下孵育30 min，PBS洗2次棄上清液，1%的多聚甲醛固定細胞，流式細胞儀上機檢測。

1.6 ELISA檢測

根據人CXCL10、CCL17ELISA試劑盒說明書分別測定細胞培養上清液中CXCL10、CCL17的水平變化，每組設3個副孔。試劑盒中針對CXCL10、CCL17的單克隆抗體已預先在試劑盒中的96孔滴度板中，標準樣品和生物素結合檢測抗體特異性CXCL10、CCL17的試劑依次被加入孔中。孵育、洗滌，最后加入顯色液和終止液，酶標儀上機分別檢測記錄在450 nm和630 nm波長下的讀數。

2 結果

2.1 CD3+T淋巴細胞純度鑒定結果

健康對照者CD3+T淋巴細胞純度為95.500 0%±1.063 0%，OLP患者中非糜爛型為96.200 0%±0.989 4%，糜爛型為96.080 0%±0.281 8%。各組T細胞純度均＞95%，且差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 流式細胞術檢測外周血T細胞表面受體CXCR3的表達

OLP患者較健康對照者，各組CXCR3表達均增強。OLP中，拮抗CXCR3組較空白組，CXCR3表達下調（P＞0.05）；拮抗CCR4組較空白組，CXCR3表達上調（P＞0.05）（圖1）。健康對照者變化與OLP患者一致，拮抗組較空白組的差異無統計學意義（P＞0.05）（圖2）。將OLP患者和健康對照者的CXCR3表達結果比較，空白組、拮抗CXCR3及CCR4組的差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 OLP患者和正常人外周血T淋巴細胞中CXCR3+T細胞的表達水平Tab 1 Expression of CXCR3+T cells in peripheral blood T lymphocytes of OLPpatients and controls

圖1 OLP患者外周血T淋巴細胞中CXCR3+T細胞的表達水平Fig 1 Expression of CXCR3+T cells in peripheral blood T lymphocytes of OLPpatients

圖2 健康對照者外周血T淋巴細胞中CXCR3+T細胞的表達水平Fig 2 Expression of CXCR3+T cells in peripheral blood T lymphocytes of controls

2.3 流式細胞術檢測外周血T細胞表面受體CCR4的表達

OLP患者較健康對照者，各組CCR4表達均增強。OLP中，拮抗CXCR3組較空白組，CCR4表達下調（P＞0.05）；拮抗CCR4組較空白組，CCR4表達顯著下調（P＜0.05）（圖3）。健康對照者趨勢與OLP患者一致，但拮抗組較空白組差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4）。將OLP患者和健康對照者的CCR4表達結果比較，空白組與拮抗CXCR3、CCR4組差異有統計學意義（P＜0.05）（表2）。

圖3 OLP患者外周血T淋巴細胞中CCR4+T細胞的表達水平 Fig 3 Expression of CCR4+T cellsin peripheral blood T lym- phocytes of OLPpatients

圖4 健康對照者外周血T淋巴細胞中CCR4+T細胞的表達水平Fig 4 Expression of CCR4+T cellsin peripheral blood T lym-phocytes of controls

表2 OLP患者和健康對照者外周血T淋巴細胞中CCR4+T細胞的表達水平Tab 2 Expression of CCR4+T cells in peripheral blood T lymphocytes of OLPpatients and controls

2.4 ELISA檢測細胞上清液中趨化因子CXCL10的表達

OLP患者較健康對照者，各組CXCL10表達均增強。OLP中，拮抗CXCR3組較空白組，CXCL10表達顯著下調（P＜0.05）；拮抗CCR4組較空白組，CXCL10表達上調（P＞0.05）（圖5）。健康對照者趨勢與OLP患者一致，但拮抗組較空白組均差異無統計學意義（P＞0.05）（圖6）。將OLP患者和健康對照者的CXCL10結果比較，空白組、拮抗CCR4組差異有統計學意義（P＜0.05），而拮抗CXCR3組差異無統計學意義（P＞0.05）。而將OLP中的非糜爛組和糜爛組分別與健康對照比較均差異無統計學意義（表3）。

表3 OLP患者和健康對照者外周血T淋巴細胞上清液中CXCL10的表達水平Tab 3 Levels of CXCL10 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of OLPpatients and controls

圖5 OLP患者外周血T淋巴細胞上清液中CXCL10的表達水平Fig 5 Levels of CXCL10 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of OLPpatients

圖6 健康對照者外周血中T淋巴細胞上清液中CXCL10的表達水平Fig 6 Levels of CXCL10 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of controls

2.5 ELISA檢測細胞上清液中趨化因子CCL17的表達

OLP患者較健康對照者，各組CCL17表達均增強。OLP中，拮抗CXCR3組較空白組，CCL17表達下調（P＞0.05）；拮抗CCR4組較空白組，CCL17表達顯著下調（P＜0.05）（圖7）。健康對照者各組間差異無統計學意義（P＞0.05）（圖8）。將OLP患者和健康對照者的CCL17表達結果比較，空白組的差異有統計學意義（P＜0.05），而拮抗CXCR3、CCR4組的差異無統計學意義。而非糜爛組和糜爛組分別與健康對照比較的差異均無統計學意義（表4）。

圖7 OLP患者外周血T淋巴細胞上清液中CCL17的表達水平Fig 7 Levels of CCL17 in the supernatant of T lymphocytes inperipheral blood of OLPpatients

圖8 健康對照者外周血中T淋巴細胞上清液中CCL17的表達水平Fig 8 Levels of CCL17 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of controls

表4 OLP患者和健康對照者外周血T淋巴細胞上清液中CCL17的表達水平Tab 4 Levels of CCL17 in the supernatant of T lymphocytes in peripheral blood of OLPpatients and controls

3 討論

研究[15]表明，趨化因子網絡系統中含有豐富的配體和受體，許多趨化因子及其受體可以作為治療自身免疫性疾病的有效靶點。趨化因子發出趨化信號招募T細胞，并在機體穩態或自身免疫性炎癥時適當調整T細胞的遷移，但在自身免疫過程中具體如何打破免疫耐受誘發炎癥尚不清。CXCR3、CCR4分別是Th1、Th2細胞的特征性趨化因子受體[16]，課題組[11-12]前期也分別對CXCL10-CXCR3、CCL17-CCR4單個軸在OLP發病機制中的作用進行了驗證，發現在OLP外周血中，CXCR3、CCR4、CXCL10、CCL17這4個指標均較正常人高表達。但具體趨化因子及受體之間有無相互作用尚不清楚，故本研究嘗試探究兩軸間的相關互作，從而為進一步闡明趨化因子及受體在OLP發病機制中的網絡調控作用提供實驗依據。

本研究發現，拮抗CCR4后，CXCR3表達上調。有文獻[17]報道稱，在慢性結核病中，CCR4缺失可加重肺部Th1炎癥和感染細菌進入肺部，并發現在CCR4先天缺陷的小鼠中，參與Th1細胞募集的相關趨化因子受體CXCR3、CCR5的基因表達均增加，CCR4的缺陷造成經由CXCR3和CCR5被招募到肺部的Th1細胞增多，加重Th1型炎癥反應。這與本實驗結果相符，由此筆者推測，CCR4對CXCR3可能存在一種負反饋調節。

本研究拮抗CXCR3后，CCR4表達下調。有研究[18]發現在干燥綜合征中，CXCR3及CXCL10與該病早期發生有關，CCR4及CCL17/CCL22與該病發展進程相關。有關慢性移植物抗宿主病（chronic graft-versus-host disease，cGVHD）的研究[19]也提出，CXCR3或CCR5與CXCL10的相互作用可能在Th1細胞遷移以及cGVHD的啟動中發揮重要作用，CCR4則與配體相互作用募集了Th2細胞并參與cGVHD的發展，這提示從CXCR3上調到CCR4上調可能是一個單向有序的遞進過程，CXCR3上調達到一定水平誘發疾病發生，之后與疾病發展進程相關的CCR4上調，因此CXCR3對CCR4可能具有正向調節作用。

本研究中各組OLP患者的CXCR3、CCR4表達均較正常人上調，課題組前期研究[12]發現，在OLP患者外周血中，Th2型反應占主導。但Th1型受體CXCR3的表達增強提示，其可能并非CXCR3或CCR4單一調節OLP的炎癥過程，而是二者共同促成OLP的發病。有文獻[15]報道稱，在以Th2型反應為主導的特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）的炎癥部位Th2、Th1信號均顯著表達，研究者[15]認為這可能是因為特應性皮炎患者皮膚屏障受損，多種抗原穿透皮膚從而引發AD的混合炎癥反應。此外，硬皮病（也稱為系統性硬化癥）炎癥性纖維化的出現也可能與混合炎癥的存在有關。結合課題組以往研究及本研究結果，關于CXCR3-CXCL10及CCR4-CCL17軸在OLP發病中的作用機制如圖9所示。

圖9 CXCL10-CXCR3軸和CCL17-CCR4軸在口腔扁平苔蘚發病機制中的作用機制Fig 9 The mechanism of CXCL10-CXCR3 axisand CCL17-CCR4 axisin thepathogenesisof oral Lichen planus

在OLP患者外周血的局部免疫應答環境中，趨化因子CXCL10、CCL17發出趨化信號招募總的T淋巴細胞至炎癥部位，并與分化為Th1、Th2型的T細胞表面的特征性受體即CXCR3、CCR4相結合。本研究推測，CXCR3對CCR4可能具有正向調節作用，而CCR4對CXCR3可能存在一種負反饋調節。CXCR3增多是CCR4增多的基礎，而當CCR4表達增強到一定程度時，CCR4則會向CXCR3發出負反饋信號，CXCR3與CCR4之間借此維持相對平衡，這一點也可能與OLP病程的慢性遷延不愈有關。趨化因子受體CXCR3、CCR4及其配體CXCL10、CXCL17的表達均增強，筆者認為在OLP的發病機制中，可能存在CXCR3、CCR4相互影響并介導的Th1、Th2型的混合炎癥反應。炎癥微環境中CXCR3-CXCL10、CCR4-CCL17軸發揮效應，促使Th1和Th2型細胞分泌更多的炎性因子，炎性因子再招募更多的T細胞，共同形成混合炎癥的正反饋循環，協同推進OLP的發展。

本研究拮抗CXCR3后，CCL17表達下調；拮抗CCR4后，CXCL10表達上調。趨化因子CXCL10、CCL17的變化趨勢和相應受體一致。但在配體結果中，總OLP組較對照組有差異，非糜爛組和糜爛組分別比較時則差異無統計學意義。分析原因可能是由于趨化因子受體往往存在多個配體，CXCR3的配體有CXCL9/10/11，CCR4的配體為CCL17/22[7,10]。OLP的臨床分型依據炎癥嚴重程度的不同可分為糜爛型和非糜爛型，其產生炎癥的過程可能是多個配體參與，或者同一趨化因子受體在OLP局部免疫反應的不同階段與不同的配體發生結合，受體與配體發揮效應共同推進炎癥的發展。故推測CXCL10和CCL17雖在OLP中異常表達，但作為OLP的臨床分型指標不夠靈敏，受體CXCR3、CCR4可能作為評價OLP疾病炎癥程度和臨床分型的指標更為準確。

綜上所述，在OLP發病機制中CXCR3對于CCR4可能存在一種正反饋調節機制，CXCR3與CCR4協同作用誘發OLP的混合炎癥反應。此外，體外實驗表明，CCR4對于CXCR3也可能存在負反饋調節作用。趨化因子受體CXCR3、CCR4作為評價OLP臨床分型的指標較其配體CXCL10、CCL17可能更為準確。通過本研究提示，CXCL10-CXCR3軸、CCL17-CCR4軸可能在趨化因子與趨化因子受體的相互作用中扮演不同角色，彼此影響并協同推進OLP疾病的發生和發展。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。