破骨細胞分化在顳下頜關節骨關節炎發生中的作用

肖勉 胡智慧 江恒華 房維 龍星

武漢大學口腔醫院口腔頜面創傷與顳下頜關節外科，湖北省口腔基礎醫學重點實驗室－省部共建國家重點實驗室培育基地，口腔生物醫學教育部重點實驗室（武漢大學），武漢430000

顳下頜關節骨關節炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA）是臨床常見的困擾患者的一種疾病，是顳下頜關節紊亂病（temporomandibular joint disorder，TMD）中的主要疾病之一，患者大多表現為疼痛以及關節功能障礙，極大地影響了患者的生活質量[1]。在影像學上，絕大多數TMJOA患者往往顯示有明顯的髁突骨質吸收和破壞，部分患者經過治療后顯示骨質破壞后的重建。骨質的破壞及改建需要破骨細胞的參與，目前為止破骨細胞在TMJOA中的作用并不清楚。

近年來許多研究表明，TMJOA的發生發展過程中伴隨著破骨細胞活性及功能的改變。通過機械性超負荷建立的TMJOA大鼠模型中，缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α被激活，抑制骨保護素（osteoprotegerin，OPG）的表達，導致破骨細胞的分化及數量增多[2]。在實驗性單側前牙咬合構建的小鼠TMJOA模型中也發現了軟骨下小梁骨的丟失，破骨細胞活性增強[3]。研究[4]發現，軟骨下骨的病理改變在TMJOA中至關重要，通過使用瑞巴派特抑制破骨細胞活性和分化可以減少軟骨下骨丟失，從而減輕TMJOA的髁突變性。也有研究[5]表明，使用炎性抑制劑白細胞介素（interleukin，IL）-37b可以抑制破骨細胞形成，有可能成為預防TMJOA的新靶點。本研究通過碘乙酸鈉（monosodium iodoacetate，MIA）建立TMJOA模型，應用抗酒石酸酸性磷酸酶染色（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）觀察TMJOA關節組織中破骨細胞的存在情況，同時在臨床上收集TMJOA患者滑液，對破骨細胞進行刺激，進一步證實破骨細胞分化在TMJOA的發生中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

RAW264.7細胞系（美國模式培養物集存庫，美國），MIA、TRAP試劑盒（西格瑪奧德里奇公司公司，美國）、蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）（武漢谷歌生物科技有限公司）、高糖杜爾伯科改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（北京海克隆生物化學制品有限公司）、重組小鼠核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）（R&D system公司，美國）、細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK8）（上海東仁化學科技有限公司）。

1.2 小鼠TMJOA模型構建

從湖北省疾控中心購買40只SPF級別的C57雄性小鼠，體重約為每只20 g，分為MIA組和鹽水組，每組20只小鼠，對于MIA組小鼠，雙側顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）上腔注入20μL濃度為1 mg/50μL MIA溶液建立TMJOA模型，鹽水組小鼠雙側TMJ上腔注入20μL生理鹽水作為對照[6]。分別在1、2、3、4周時對小鼠（每周5只）進行安樂死，通過腹腔注射過量的戊巴比妥鈉溶液致死小鼠，取小鼠TMJ標本。動物實驗的實驗步驟已獲得武漢大學口腔醫學院倫理委員會的批準（批準號：S07919020F）。

1.3 Micro-CT檢測

將上述建模后的MIA組和鹽水組小鼠的TMJ標本在4%多聚甲醛中固定24 h，然后沖水過夜，然后每周每組取4個標本通過SkyScan1176型Micro-CT儀（布魯克公司，德國）對標本進行三維分析，觀察TMJOA模型的構建情況以及小鼠TMJ髁突骨質的破壞情況，通過Micro-CT分析軟件CTAn分析MIA組和鹽水組小鼠髁突軟骨下骨的骨小梁間距（trabecular separation，Tb.Sp）是否存在差異。

1.4 HE染色

將Micro-CT掃描后的32只關節標本以及其余未進行掃描的8只關節標本一起置于10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acide，EDTA）中脫鈣2個月。脫鈣完成后，將標本在梯度乙醇中進行脫水，石蠟包埋，4μm進行連續切片，烤片備用；將切片標本置于梯度乙醇中脫蠟入水，滴加蘇木素溶液浸染3 min，流水沖洗3 min，徹底沖去染液；然后滴加伊紅溶液浸染30 s，流水沖洗5 s；將玻片放置在通風櫥中風干，二甲苯透明，中性樹脂封片；最后在顯微鏡下觀察拍照。

1.5 TRAP染色

將上述烤片完成后的切片標本置于梯度乙醇中脫蠟入水，按照TRAP試劑盒的步驟配置染液，避光滴染，在37℃溫箱中孵育1 h；蒸餾水洗3次，每次3 min；蘇木素復染50 s，沖水反藍；待自然干燥，透明，封片。對培養的破骨細胞進行染色時，首先，吸除掉培養皿中的培養基，生理鹽水浸洗3次，每次3 min；按照TRAP試劑盒的步驟配置細胞固定液并加入皿中，30 s；吸除固定液，生理鹽水浸洗3次，每次3皿；避光下，將配置好的染色液滴入皿中，在37℃溫箱中孵育1 h；然后吸出染色液，生理鹽水浸洗3次，每次3 min，最后在顯微鏡下觀察拍照。

1.6 培養RAW264.7細胞系并誘導分化為破骨細胞

將RAW264.7細胞系置于含10%FBS和90%DMEM的培養基中，在37℃、95%O2、5%CO2的培養箱中孵育，每1～2 d在顯微鏡下觀察細胞生長情況和貼壁狀況，并更換培養液，待細胞貼滿皿底50%～60%時進行傳代培養[7]。

將剛傳代的RAW264.7細胞置于含有10%FBS和90%DMEM的培養基中，并向培養基中加入10ng·mL-1的RANKL，在37℃、95%O2、5%CO2的培養箱中孵育，每天在顯微鏡下觀察細胞的生長情況和貼壁狀況，大約1周左右可觀察到破骨細胞的分化。

1.7 關節滑液對破骨細胞生長以及分化的影響

1.7.1 收集滑液TMJOA組的滑液取自TMJOA患者，共6例，都為女性，12～53歲。采集方法：取含2 mL生理鹽水的5 mL注射器，將生理鹽水注入患者TMJ上腔，然后抽回，反復灌洗3次，最終得到2 mL稀釋后的關節腔滑液。將得到的滑液在4℃下離心，棄去下方沉淀的血塊，保存于-80℃冰箱，將此作為滑液樣本的原液[8]。人體研究獲得武漢大學口腔醫學院倫理委員會的批準（批準號：2014LUNSHENZI24），患者簽署知情同意書。

1.7.2 滑液對細胞生長的影響 將剛傳代的RAW-264.7細胞分為8個組，第1組為RAW264.7細胞；第2組為RAW264.7細胞加入RANKL刺激；第3～8組為RAW264.7細胞加入RANKL刺激，同時分別加入6個不同患者的10%濃度的滑液原液。以上8組均置于10%FBS、90%DMEM的培養基中，在37℃、95%O2、5%CO2的培養箱中孵育，每天在顯微鏡下觀察細胞的生長和分化情況，1周后按照說明書對細胞進行CCK8實驗，通過NanoDrop 1000型紫外分光光度儀（賽默飛世爾科技有限公司，美國）測量細胞在450 nm處的吸光光度（optical delnsity，OD）值，統計OD值并分析各組之間的OD值是否有差異，進而分析各組之間細胞生長活性是否有差異。

1.7.3 滑液對破骨細胞分化的影響 將剛傳代的RAW264.7細胞分為空白對照組、對照組和刺激組，空白對照組加入10%FBS、80%DMEM和10%生理鹽水；空白對照組加入10%FBS、80%DMEM、10 ng·mL-1RANKL和10%生理鹽水，刺激組中加入10%FBS、80%DMEM、10 ng·mL-1RANKL和10%TMJOA患者滑液，該滑液是從上述6名患者滑液樣本中隨機選取的一個。每天在顯微鏡下觀察細胞的生長情況和分化情況，并拍照記錄。

1.8 統計學處理

采用GraphPad Prism8對數據進行分析，數據采用±s表示，通過t檢驗來比較組間差異，對組間和組內差異采用方差分析。P＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 建模觀測

2.1.1 小鼠TMJOA動物模型Micro-CT分析結果Micro-CT結果顯示：鹽水組髁突形態正常，骨質結構完整；MIA組1周時髁突骨質有輕微破壞，骨白線模糊，2周和3周骨質破壞嚴重，出現骨小梁稀疏與減少，同時髁突表面形態改建，可同時觀察到骨質增生和吸收；4周時骨質破壞減輕，2周時MIA組骨小梁間距高于鹽水組，差異有統計學意義（P＜0.000 1）（圖1、2）。

圖1 鹽水組和MIA組髁突骨質Tb.Sp結果統計Fig 1 Statistics of Tb.Sp results of condylar bonein saline group and MIA group

圖2 鹽水組和MIA組在不同時間點髁突骨質情況Fig 2 The condylar bonecondition of salinegroup and MIA group at different timepoints

2.1.2 HE染色結果 建模第2周，顯微鏡下HE染色顯示，鹽水組軟骨層次清楚，軟骨下骨結構正常；MIA組軟骨細胞凋亡，層次不清，軟骨下骨結構紊亂（圖3）。

圖3 TMJ髁突第2周HE染色Fig 3 HE staining of condyle of TMJ in the second week

2.2 TRAP染色結果

1周和2周MIA組的關節區域破骨細胞數量增多，差異有統計學意義（P＜0.005），3周和4周時，兩組關節區域的破骨細胞數量區別不大（圖4、5）。

圖4 鹽水組和MIA組髁突不同時間點TRAP染色Fig 4 TRAP staining of condyle in saline group and MIA group at different time points

圖5 鹽水組和MIA組在不同時間點破骨細胞數量統計Fig 5 The number of osteoclasts in saline group and MIA group was counted at different time points

2.3 TMJOA患者滑液促進破骨細胞分化

第3～8組與第1、2組的OD值之間的差異無統計學意義，即可認為其細胞活性的差異無統計學意義（圖6），即細胞活性是相同的，因此可以認為滑液的細胞毒性對細胞的生長無明顯影響。

圖6 細胞活性檢測Fig 6 Cell viability test

RAW264.7細胞生長情況如圖7所示，誘導分化的破骨細胞多核（大于等于2個核），呈紫紅色，細胞體積遠大于分化前RAW264.7細胞，加入TMJOA患者滑液刺激后，破骨細胞的分化明顯增多，且細胞體積大小也相比對照組更大；刺激組破骨細胞數量多于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.000 1）（圖8）。

圖7 破骨細胞分化情況Fig 7 The differentiation of osteoclasts

圖8 對照組和刺激組破骨細胞數量統計Fig 8 The number of osteoclasts in control group and stimulation group was statistically analyzed

3 討論

本研究發現在TMJOA小鼠模型中，通過Micro-CT可以觀察到骨白線的消失，出現骨小梁稀疏與減少，同時髁突表面形態改建，組織學上發現髁突破骨細胞增多，髁突骨質破壞，提示破骨細胞可能參與TMJOA的發生及發展。

在完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA）誘導的炎性TMJ中，炎癥前期破骨細胞數量顯示增多，同時髁突骨質丟失嚴重，而這種TMJ炎癥狀態是TMJOA的重要危險因素[9]；在MIA注射誘導的TMJOA中，髁突出現比較明顯的骨破壞[10]。也有研究[5]發現，炎癥抑制劑IL-37b可以通過抑制破骨細胞的形成來預防TMJOA。破骨細胞抑制劑阿侖膦酸鈉，可以改善膝關節OA大鼠 的疼痛程度[11]。

關節滑液是TMJ重要成分，在TMJOA中有重要作用。在TMJOA疾病過程中，往往伴隨著滑膜炎癥，同時滑膜組織分泌的滑液成分會發生很大變化[12]。以往的研究表明，滑膜炎癥后導致促炎因子的分泌增多或者是通過促進血管化來參與TMJOA的疾病進展。在TMJOA患者滑液中，已經檢測到幾種炎性細胞因子的水平升高，如IL-12、IL-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α[13]，這些促炎因子可通過核因子（nuclear factor，NF）途徑，調節金屬基質蛋白酶的表達來影響關節內的分解代謝。同時研究[14-15]發現，與血管生成相關的細胞因子，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、高遷移率族盒染色體蛋白-1等，在滑液、關節盤等組織中的表達均升高，這些促血管生成因子可以促進血管長入到無血管結構的關節盤和軟骨，進而影響其結構與功能。更有研究[16]表明，低氧又可誘導VEGF激活，通過HIF-1α-VEGF-Notch途徑促進髁突軟骨的血管生成。這些炎癥因子和促血管生成因子通過一系列的信號通路，可能同時也對破骨細胞的分化及活性起到調控作用，進而引起軟骨下骨的骨質吸收、紊亂和改建[17]。

有研究[18]表明，TMD患者的滑液可以誘導破骨細胞分化，在膝關節置換術后并發假體周圍關節感染的患者滑液中，IL-16含量增高，IL-16可以通過依賴于c-Jun氨基末端激酶/絲裂原活化蛋白激酶信號通路，活化激活T細胞核因子1蛋白（nuclear factor of activated T-cells,cytoplasmic 1，NFATc1），直接導致單核細胞分化為破骨細胞樣細胞。本研究發現，TMJOA患者滑液可以在體外促進破骨細胞分化，TMJ腔內的滑液可能通過影響破骨細胞的活性與分化來介導TMJOA的疾病進程。

以往大量研究探索了破骨細胞分化和功能活性的具體機制，除了經典的通過集落刺激因子、RANKL等細胞因子調控，激活NF-κB和NFATc1等重要信號通路，從而刺激破骨細胞分化外。近年來，有研究發現了獨立于RANKL途徑的促進破骨細胞分化的機制，包括腫瘤壞死因子超家族成員T淋巴細胞表達的受體、增殖誘導配體和B細胞活化因子，以及生長轉化因子-β、IL-6、IL-8、IL-11和神經生長因子等。但是，在這些促進破骨細胞分化的分子機制中，還需要進一步研究哪些與TMJOA滑液刺激破骨細胞分化有關，同時，也更需要探索新的可能的分子通路來闡明TMJ骨關節病的致病機制。

總而言之，TMJOA中滑液成分與破骨細胞分化數量及其活性較為相關，但主要起作用的成分以及其中具體的作用機制還不甚清楚，還需要更多的研究來探索。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。