3株豬源綠色氣球菌的分離鑒定

錢麗敏，何依蓉，陳夢婷，陳培富

(云南農業大學動物醫學院，昆明 650201)

氣球菌屬介于葡萄球菌屬和鏈球菌屬之間，其模式種為綠色氣球菌(Aerococcusviridans)[1]，還包括尿道氣球菌、柯氣球菌、血氣球菌和人尿氣球菌[2]。綠色氣球菌是一類重要的機會致病菌[3]，廣泛存在于自然界，如空氣、土壤、動植物以及健康動物體表，若未做好消毒，可隨空氣和粉塵傳播。綠色氣球菌也被視為一種人獸共患病原菌，當人和動物機體免疫力水平降低、免疫功能不健全以及體表產生開放性外傷時，可引起人尿道感染、心內膜炎、主動脈假性動脈瘤及皮膚血管炎等疾病[4-6]。據報道[7]，綠色氣球菌感染可增加豬患其他感染性疾病的風險，最終導致仔豬生長發育受阻，出欄時間延遲，乃至引起死亡，造成重要經濟損失。

近年，云南省不同地區3個豬場陸續發生多起仔豬非急性死亡病例，患病仔豬均表現出明顯的四肢運動障礙。2015年3月芒市某小型豬場仔豬群發病，前期表現發熱和呼吸困難，呈犬坐姿勢，后期腹瀉和四肢僵直，死亡率高達10%，病理剖檢見胸腔有積液、肝臟有腫塊、肺臟呈蝦肉樣病變，與胸膜粘連，肺組織經PCR擴增檢出豬肺炎支原體陽性。2018年4月富民縣某豬場部分2月齡仔豬出現生長緩慢，肌肉震顫，后期出現體溫升高、全身皮膚潮紅，跛行，無法站立，按壓背部及臀部肌肉表現疼痛，經青霉素連續治療4 d，無效死亡，剖檢發現頜下淋巴結顯著腫大。2019年1月祿勸縣某養豬場發生溫和型豬瘟(取白細胞經RT-PCR擴增檢測豬瘟病毒核酸呈陽性)，病豬全身體表發紅，精神沉郁，肌肉震顫，關節腫脹，死前口鼻流血。為確定以上3個豬場仔豬發生四肢運動障礙的病原因素，無菌采集病死仔豬內部組織樣品進行病原檢測，為防控此類疾病提供必要的參考依據。

1 材 料

1.1 病料來源 分別從上述各豬場發病期間采集病豬組織樣品。芒市小型豬場無菌采集病死仔豬脾臟、肝臟和肺臟各5份；富民縣某豬場無菌采集病死仔豬肝臟、脾臟、頜下淋巴結、腹股溝淋巴結及心包積液各2份；祿勸縣某養豬場采集3月齡患病仔豬抗凝血液2份。

1.2 主要試劑 小量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Lot：EG101-01)購自北京全式金生物技術有限公司，DH5α感受態大腸桿菌細胞(Lot：CB101)購自天根生化科技有限公司，胰蛋白酶大豆胨綿羊血瓊脂等細菌培養基由實驗室自行配制。

1.3 儀器設備 PCR 儀(型號EDC-810)購自北京東勝創新生物科技有限公司；高速離心機(型號H1650-W)購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；凝膠成像系統(型號GELDOC-XR)購自BIO-RAD；電熱恒溫培養箱(型號303-S)購自滬南試驗儀器廠；超低溫冰箱購自日本SANYO 公司；立式壓力蒸汽滅菌器(型號YXQ-50SII)購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

2 方 法

2.1 細菌分離培養 無菌取病變組織或體液涂布綿羊血瓊脂、LB瓊脂，37 ℃培養24 h，挑取單個菌落繼續做劃線培養，直至形成外觀形態完全一致的菌落，隨機挑取單菌落少許菌樣做革蘭染色，鏡檢并記錄細菌個體形態。

2.2 生化試驗 對細菌純培養物進行葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、山梨醇、棉籽糖、七葉苷、乙酰甲基甲醇(VP)等生化試驗。37 ℃培養24 h，記錄反應結果。挑取經液體培養的細菌置于兩張潔凈玻片上，一張滴加少量現配的3% H2O2溶液，另一張滴加蒸餾水作為對照，觀察觸酶試驗結果。

2.3 分離菌株16S rRNA基因序列測定 取1 mL新鮮培養菌液12000 r/min離心5 min棄上清，留取沉淀，按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取菌株DNA，以其為模板進行16S rRNA基因的PCR擴增。16S rRNA基因通用引物[8](上游引物：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游引物：5′-CGG CTA CCT TGT TAC GAC TT-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環；最后72 ℃延伸反應10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴增產物，膠回收產物做TA克隆，隨機取白色菌落樣品送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將所獲基因片段序列于NCBI網站進行BLAST分析，選取同源性最高的7條序列(GenBank：CP014164、CP046334、GQ161096、HQ465288、KU922464、MG576151、MN932266)為參考序列，應用MEGA6.0軟件構建系統發育樹。

2.4 藥敏試驗 選用9種獸醫臨床常用抗菌藥物，以紙片擴散法(K-B法)測定菌株敏感性。取純培養菌液150 μL均勻涂布于M-H瓊脂平板表面，每個平板貼4～5片藥敏片，37 ℃培養18～24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，按說明書判定菌株敏感性。

3 結果與分析

3.1 細菌分離培養 芒市脾臟樣品、富民縣肝臟和淋巴結樣品、祿勸縣血液樣品在血瓊脂均只形成白色圓形、隆起光滑、直徑約1 mm并產生明顯溶血環的菌落(圖1)，轉種LB瓊脂，均形成光滑、平整的灰白色小菌落(圖2)。分離菌株依次命名為ASV-1、ASV-2和ASV-3。革蘭染色鏡檢為陽性球菌，可見四聯、成團塊狀排列，也有單個或成雙排列(圖3)。

圖1 血瓊脂菌落形態Fig 1 The morphology of colonies on blood agar

圖2 LB瓊脂菌落形態Fig 2 The morphology of colonies on LB agar

圖3 革蘭染色(1000×)Fig 3 The Gram stain(1000×)

3.2 生化鑒定 3個菌株都分解葡萄糖、蔗糖、木糖、山梨醇;不分解麥芽糖、棉籽糖、蕈糖、七葉苷、水楊苷，VP試驗為陰性，不還原硝酸鹽。觸酶試驗均為陰性。

3.3 16S rRNA基因擴增及測序結果 將所獲3個菌株的16S rRNA基因序列擴增產物分別通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均在1500 bp左右處出現單一的光亮條帶(圖4-圖6)，與預期擴增產物大小相符。

M:DL2000 DNA Marker；1-2:菌株ASV-1圖4 菌株ASV-1 16S rRNA基因PCR擴增產物Fig 4 The PCR amplicon of ASV-1 16S rRNA gene

M:DL2000 DNA Marker；1-3:菌株ASV-2圖5 菌株ASV-2 16S rRNA基因PCR擴增產物Fig 5 The PCR amplicon of ASV-2 16S rRNA gene

M:DL2000 DNA Marker；1:菌株ASV-3圖6 菌株ASV-3 16S rRNA基因PCR擴增產物Fig 6 The PCR amplicon of ASV-3 16S rRNA gene

3.4 系統進化分析 所獲3個分離菌株16S rRNA基因序列經BLAST分析，顯示與GenBank收錄的7株綠色氣球菌參考菌株的同源性均在99%以上，據此將其判定為綠色氣球菌。系統發育樹顯示3個分離菌株高度相似，且與印度分離株MG576151的遺傳距離最近(圖7)。

圖7 基于16S rRNA基因序列的系統發育樹Fig 7 The 16S rRNA gene-based phylogenetic tree

3.5 藥敏試驗結果 表1結果顯示：3個菌株均對頭孢曲松、恩諾沙星、青霉素、氟苯尼考、克拉霉素、呋喃唑酮敏感，對卡那霉素、慶大霉素、復方新諾明等藥物不敏感。

表1 藥敏實驗結果Tab 1 The results of drug susceptibility tests

4 討論與結論

近些年，綠色氣球菌感染動物機體造成的危害引起人們逐步重視。越來越多的研究表明，綠色氣球菌可以感染多種動物，國外主要從水產動物中分離到綠色氣球菌，如龍蝦、鰲蝦[9]；國內報道最多的主要是人和仔豬的感染，從山羊、奶牛及竹鼠中也分離到綠色氣球菌[10-12]，可見此菌感染的宿主范圍很廣。Clark等[9]研究發現，綠色氣球菌的強毒株莢膜對美洲龍蝦有強致病力；Liu等[11]從患乳房炎的奶牛乳汁中分離到綠色氣球菌，并發現此菌具有粘附和侵襲乳腺上皮細胞的能力。Sun等[13]也發現，夏季由綠色氣球菌引起乳腺炎的比率最高，表明此菌是引起奶牛亞臨床乳腺炎的重要病原。當然，綠色氣球菌的致病性差異可能與菌株毒力和宿主種類有關。

本試驗所獲3株綠色氣球菌分別源自云南省不同地區、不同年份的3個養豬場，證實此菌廣泛存在于養豬環境，但未見其單獨有強致病力的報道。Pan等[14]研究發現，從患病仔豬的關節液、腦脊液和肺臟中分離到豬鏈球菌和綠色氣球菌，兩種病原菌混合感染可引起仔豬和小鼠急性腦膜炎，且兩種病原菌“協同作用”引起小鼠的死亡率顯著高于單一病原菌引起的死亡率。這3個豬場患病仔豬雖然均表現肢體運動障礙，其他臨床癥狀不盡相同，可能與其原發性感染疾病不同有關。根據疾病前期或同期的核酸檢測結果，可以判定芒市病例發生的原發性感染為豬支原體肺炎，祿勸縣病例則由豬瘟病毒(CSFV)引起原發性感染。富民縣病例未及時做其他病原檢測，但出現天生痙攣癥和“僵豬”樣狀態，這是CSFV垂直傳播引起先天感染的典型特征。CSFV具有淋巴細胞及上皮細胞嗜性，是引起豬免疫力下降而繼發感染其他病原菌的主要因素。韓慶安等指出CSFV與其他病原體的混合感染非常普遍，與CSFV發生混合感染的病原體主要見于仔豬群及流產胎兒但在發育正常的育肥豬群中未檢測到[15]。此外，所處地理位置、氣候因素及養殖環境不同的養殖場，引起繼發感染的機會致病菌種類可能差異，本研究發現的是綠色氣球菌感染。富民縣發病仔豬雖采用分離菌株敏感的青霉素治療，但仍死亡，可能因為感染已導致器官功能衰竭。Marein等[16]從不同患病豬關節液、腦積液及肺臟中分離到58株綠色氣球菌，指出該菌可能是豬的致病菌；但劉潔等分離出的8株綠色氣球菌，并未引起正常小鼠的發病或死亡[17]，進一步表明該菌為機會致病菌。

目前，綠色氣球菌引起動物發病的相關機理尚不清楚，但凡能降低動物免疫功能的因素，如營養不良、天氣驟變、免疫抑制病毒感染、應激反應等，都有可能引起綠色氣球菌等機會致病菌的感染[18]。鑒于所調查病豬普遍預后不良，預防或消除導致免疫力下降的原發性感染才是避免或控制綠色氣球菌機會感染的根本辦法。

本研究從不同年份、不同地區的3個豬場病料中均只分離到綠色氣球菌，提示其存在重要的致病性，并有必要深入調查其毒力因子、感染途徑以及造成繼發感染的前置或協同因素，以設法減少該菌感染引起的經濟損失。