miR-127-3p對氣道瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白分泌的影響

葉乃郗 何杰 李小燕 王國棟 余覓 張維 肖秋紅 任召強(qiáng) 孫建李萬成

1成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院、第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 610500;2煙臺市牟平區(qū)中醫(yī)醫(yī)院病理科 264100

良性氣道瘢痕狹窄是由多種病因引起的一種氣道肉芽組織增生、攣縮或軟骨塌陷導(dǎo)致的氣道阻塞性疾病,重度的氣道狹窄可引起患者迅速出現(xiàn)呼吸衰竭甚至窒息死亡[1-2]。在歐美國家,良性氣道瘢痕狹窄的主要病因是氣管插管或氣管切開等機(jī)械性損傷導(dǎo)致的瘢痕增生[3]。在我國,隨著呼吸機(jī)輔助呼吸技術(shù)的廣泛開展,由機(jī)械通氣損傷引起的良性氣道狹窄也在逐年增多[4]。據(jù)統(tǒng)計,大約20%的良性中央氣道狹窄是由氣管插管或氣管切開所引起的[5]。研究表明,多種分子機(jī)制可導(dǎo)致氣道瘢痕狹窄,如氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化,生長因子、炎癥因子刺激成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化,過多的膠原蛋白分泌,Wnt/β-catenin信號通路激活加速氣道軟骨的破壞等[6-8]。由于多種分子機(jī)制相互作用,進(jìn)而導(dǎo)致了氣道狹窄的形成。

微小RNA (mircroRNA,miRNA)是細(xì)胞中重要的調(diào)控因子,多種組織器官的細(xì)胞分化、病理性纖維化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等重要的生理病理過程都有它的參與[9]。Zhang等[10]通過miRNA 微陣列芯片研究指出人皮膚瘢痕組織中存在著差異表達(dá)的miRNA,且這些miRNA 與瘢痕發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Wang 等[11]研究表明miR-21 可以通過調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路抑制皮膚瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖。氣道瘢痕和皮膚瘢痕的形成機(jī)制有相似之處,然而,對于miRNA 對靶基因的定位及其在氣道瘢痕中的調(diào)控機(jī)制尚未見研究。因此,本課題組通過提取氣道狹窄后瘢痕組織樣本中的RNA 進(jìn)行芯片分析,篩查出有表達(dá)差異的miRNA,并研究表達(dá)差異顯著的miRNA 對氣道瘢痕成纖維細(xì)胞的作用,希望對氣道狹窄的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 組織樣本均來源于2018年1月至2020年1月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科就診的良性氣道瘢痕狹窄的患者8例。其中男4例,女4例。年齡范圍為34～64歲,平均年齡(50.50±11.52)歲。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)因氣管插管或氣管切開或外傷導(dǎo)致中央氣道狹窄;(2)經(jīng)氣管鏡取氣道新生肉芽組織后病理檢查均證實為增生性瘢痕組織。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)由于肺部腫瘤導(dǎo)致的氣管狹窄;(2)合并有嚴(yán)重肝腎功能不全、凝血障礙或心肺功能不全;(3)合并其他部位腫瘤。瘢痕組織標(biāo)本取自最典型氣道瘢痕中央?yún)^(qū)域,正常氣道黏膜組織取自非瘢痕狹窄區(qū)域。本研究經(jīng)過成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),所有的組織樣本采集均獲得患者本人及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 主要材料與儀器 0.25% Ⅰ型膠原酶購自廣州銳博生物有限公司;DMEM 培養(yǎng)液、MTT 試劑、胎牛血清購自美國Gibco公司;磷酸鹽緩沖液、細(xì)胞裂解液、二甲基亞砜、0.25%胰蛋白酶、Trizol購自上海善然生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;miR-127-3p模擬物、NC 模擬物、miR-127-3p抑制物、NC 抑制物及各種引物購自杭州海潤生物科技有限公司;絲裂原活化蛋白激酶4 (mitogen-activated protein kinase 4,MAPK4)、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白及α-平滑肌肌動蛋白 (smooth muscle actin-α,α-SMA)、GAPDH 抗體及二抗購自萬類生物科技有限公司;SYBR Green購自美國Promega公司,Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自上海懿貝瑞生物科技有限公司,雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒及pmirGLO 載體購自杭州海潤生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織RNA 提取 從液氮中拿出部分組織標(biāo)本,將其粉碎后添加1 ml Trizol并使其充分混合,200μl三氯甲烷滴入混合液中。將混合液離心,加入500μl異丙醇,并再次離心后留取沉淀。滴注DEPC 處理水溶解沉淀,孵育10 min,-80 ℃保存。

1.3.2 基因芯片分析 將最終得到的miRNA 片段送至廣州輝俊生物科技有限公司進(jìn)行芯片分析。本研究檢測miRNA 的差異表達(dá),由送檢的8對氣道瘢痕組織和正常氣道黏膜組織的RNA 提供。芯片(Agilent Human 2.0 microRNAs表達(dá)譜芯片)由廣州輝俊生物科技有限公司提供,其數(shù)據(jù)源于Sanger miR Base數(shù)據(jù)庫 (http://www.mirbase.org),用R 軟件 (版本號3.6.1)繪制熱圖。選擇表達(dá)差異基因最明顯的miR-127-3p作為研究對象,采用公共數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站TargetScan Human (http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-127-3p的下游靶基因,選擇預(yù)測分值最高的靶基因進(jìn)行研究。

1.3.3 氣道瘢痕成纖維細(xì)胞的分裂和培養(yǎng) 將用于成纖維細(xì)胞分離的組織,用PBS 沖洗液沖洗3遍,進(jìn)而剪碎,添加0.25%Ⅰ型膠原酶溶解,在37 ℃下振蕩 (120 r/min)消化3 h。用等體積的含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液終止上述混合液的消化,進(jìn)而用200目篩網(wǎng)過濾,收集到離心管后棄去上清液,用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞,按照4×104cells/cm2的密度接種于100 mm 培養(yǎng)皿中,繼續(xù)培養(yǎng),置于37 ℃,5% CO2條件下。后面的實驗細(xì)胞使用第2代和第3代細(xì)胞。

1.3.4 miR-127-3p模擬物與抑制物轉(zhuǎn)染實驗 將瘢痕成纖維細(xì)胞接種于6 孔板中,根據(jù)Lipofectamine2000說明書將100 nmol/L的NC 模擬物、miR-127-3p模擬物、miR-127-3p 抑制物分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入瘢痕成纖維細(xì)胞中;安靜放置20 min后,先加入培養(yǎng)基,再倒入平板內(nèi)混合均勻;后續(xù)實驗在轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行。

1.3.5 RT-PCR 反應(yīng) 根據(jù)Ta KaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書,使RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA,繼而用SYBR試劑盒進(jìn)行RT-PCR 反應(yīng),使其進(jìn)行反應(yīng)40 個循環(huán),以U6 為內(nèi)參檢測miR-127-3p,以GAPDH 為內(nèi)參檢測其他指標(biāo)。采用ABI Prism 7500 SDS軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。引物見表1。

表1 RT-PCR 引物序列

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡 (Western-blot)檢測 使用裂解緩沖液后在細(xì)胞和組織中提取出蛋白,進(jìn)而對其蛋白檢測。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳(80～130 V),100 V 轉(zhuǎn)印1 h,用脫脂奶粉封閉2 h,一抗4℃孵育過夜,二抗室溫孵育1 h,ECL發(fā)光。通過Western-blot成像系統(tǒng)采集圖像,并分析條帶結(jié)果。

1.3.7 雙熒光素酶報告實驗 利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增MAPK4片段,并克隆到新建報告載體pmir GLO上,突變pmir GLO-MAPK4-WT 上miR-127-3p結(jié)合位點利用Stragene點突變試劑盒,新建報告載體pmir GLO-MAPK4-Mut。使用miR-127-3p模擬物或NC 模擬物轉(zhuǎn)染至成纖維細(xì)胞,用Dual Luciferanse?Reporter Assay system 試 劑 盒 和Promega GLOMAX 發(fā)光儀在48 h 后檢測各組細(xì)胞海腎熒光素酶活力。

1.3.8 MTT 實驗 在96孔培養(yǎng)板中接種細(xì)胞,按照1×104的數(shù)量;放在37 ℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,分別轉(zhuǎn)染miR-127-3p模擬物/陰性對照/空白對照在瘢痕成纖維細(xì)胞中;在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72 h 4個時間點,用MTT 法檢測各組成纖維細(xì)胞的增殖情況。MTT 檢測法為:培養(yǎng)結(jié)束后在每個孔中加入5 mg/L 的MTT 試劑20 ml,在37℃條件下孵育4 h,然后添加培養(yǎng)液,在各孔中加入150 ml二甲基亞砜,置于振蕩器內(nèi)振蕩10 min,最后放置在酶標(biāo)儀中進(jìn)行上機(jī)檢測,在570 nm 波長處測定其吸光度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布,以±s表示,使用非配對t檢驗對各組進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氣道瘢痕狹窄氣管鏡檢查及病理情況 病例詳細(xì)資料見表2,部分病理及氣管鏡圖像見圖1～3,所有患者均經(jīng)氣管鏡下介入治療并鉗夾狹窄處瘢痕組織,狹窄程度有所緩解。

圖1 病例1病理報告顯示氣管黏膜中出現(xiàn)大量呈結(jié)節(jié)狀或漩渦狀分布形成膠原小結(jié)節(jié)的纖維組織增生,診斷增生性瘢痕組織 HE×100 圖2 病例1氣管鏡見氣管上段瘢痕樣新生物 圖3 病例2氣管鏡見氣管中段黏膜攣縮及瘢痕樣新生物

表2 8例氣道瘢痕狹窄患者的基本資料

2.2 高通量miRNA 芯片篩選出差異表達(dá)的miRNA 芯片檢測結(jié)果提示:氣道瘢痕與正常氣道黏膜組織中存在多種不同表達(dá)的miRNA。其中miR-409-3p、 miR-382、 miR-203、 miR-493-5p、miR-154表達(dá)上調(diào),miR-127-3p、miR-92 表達(dá)下調(diào)。見圖4。

圖4 芯片分析發(fā)現(xiàn)在氣道瘢痕組織和正常氣道黏膜組織中多種miRNA 存在差異 (n=8)

2.3 miR-127-3p在氣道瘢痕組織中的表達(dá) 為了進(jìn)一步驗證芯片的分析結(jié)果,對氣道瘢痕組織和正常氣道黏膜組織進(jìn)行miR-127-3p 的RT-PCR檢測。結(jié)果顯示,與正常氣道黏膜組織 (0.946±0.012) 相 比, miR-127-3p 在 氣 道 瘢 痕 組織(0.512±0.014)中表達(dá)明顯降低 (t=66.572,P＜0.05)。見圖5。

圖5 正常氣道黏膜組織和氣道瘢痕組織中miR-127-3p的表達(dá)

2.4 miR-127-3p與MAPK4可靶向結(jié)合 芯片分析結(jié)果表明miR-127-3p在氣道瘢痕組織中表達(dá)明顯下調(diào)。通過公共數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站TargetScan Human預(yù)測miR-127-3p的下游靶基因,發(fā)現(xiàn)miR-127-3p可與多個下游靶基因結(jié)合,根據(jù)預(yù)測分?jǐn)?shù)的最高值,選擇MAPK4為研究的下游靶基因。MAPK4的3'UTR 可與miR-127-3p相結(jié)合,見圖6。

圖6 TargetScan Human預(yù)測miR-127-3p與MAPK4間具有靶向結(jié)合位點

本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關(guān)系,并根據(jù)預(yù)測結(jié)合區(qū)域序列構(gòu)建了MAPK4-WT-3'UTR 和MAPK4-Mut-3'UTR。結(jié)果顯示:miR-127-3p高表達(dá)會明顯導(dǎo)致含有野生型MAPK4質(zhì)粒的熒光素酶活性被抑制 (P＜0.05),但對于突變型MAPK4質(zhì)粒的熒光素酶活性并無明顯抑制作用。見圖7。

圖7 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果

2.5 miR-127-3p對MAPK4 的作用 通過miR-127-3p模擬物和抑制物的轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)miR-127-3p可以在蛋白和mRNA 水平上抑制MAPK4 的表達(dá),同時miR-127-3p可減少α-SMA 的分泌,抑制Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白生成。見圖8、9。

圖8 各組MAPK4、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ膠原蛋白及α-SMA的m RNA 表達(dá)

2.6 miR-127-3模擬物轉(zhuǎn)染對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力的影響 瘢痕成纖維細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-127-3p模擬物后,在48 h及72 h,成纖維細(xì)胞吸光度值明顯少于陰性對照組和空白對照組 (P值均＜0.05)。見圖10。

圖9 各組MAPK4、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白及α-SMA的蛋白表達(dá) A:電泳圖;B:柱狀圖

圖10 過表達(dá)miR-127-3p對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖能力的影響

3 討論

氣道瘢痕引起的狹窄在輕者會出現(xiàn)喘息、氣促等表現(xiàn),重者可引發(fā)嚴(yán)重的呼吸衰竭,此外氣道狹窄還會導(dǎo)致慢性咳嗽、排痰困難、繼發(fā)性肺炎等相關(guān)疾病,給患者身心造成嚴(yán)重的危害[12-13]。氣道狹窄的產(chǎn)生機(jī)制和病理學(xué)特點其本質(zhì)也是增生性瘢痕,與皮膚增生性瘢痕非常相似,都是在機(jī)體組織受到過度損傷的情況下發(fā)生了異常修復(fù),導(dǎo)致了纖維組織過度增生,并且成纖維細(xì)胞大量向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[14-15]。研究表明,成纖維細(xì)胞的過度增殖伴隨著大量的細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白以及糖蛋白的沉積,而成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中會導(dǎo)致α-SMA 增高,使膠原蛋白分泌增加,膠原纖維排列的結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重紊亂[16]。雖然現(xiàn)在國內(nèi)外對氣道瘢痕開展了一系列的研究并取得了一定成功,但氣道瘢痕狹窄的機(jī)制仍然不清。近年來,隨著高通量測序技術(shù)的普及,在腫瘤領(lǐng)域已報道m(xù)iRNA 參加了多種生理病理過程,如細(xì)胞分化、組織發(fā)育、組織修復(fù)和纖維化等[17],在皮膚研究領(lǐng)域里,miRNA 也被報道參與了皮膚瘢痕的進(jìn)展[18],但對于miRNA 在氣道瘢痕中的表達(dá)和功能卻少有研究。

本研究通過芯片分析技術(shù)篩查了氣道瘢痕組織中差異性表達(dá)的miRNA,發(fā)現(xiàn)miR-127-3p在瘢痕組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)趨勢,通過RT-PCR 檢測瘢痕組織中miR-127-3p的表達(dá),也驗證了芯片測序的結(jié)果。接著通過公共數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-127-3p的靶基因,發(fā)現(xiàn)MAPK4基因不僅是miR-127-3p靶基因中預(yù)測分?jǐn)?shù)最高的,而且可能在氣道瘢痕形成中也發(fā)揮著作用。哺乳動物體內(nèi)廣泛存在著的一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白酶,稱為MAPK。MAPK 相關(guān)通路參與了細(xì)胞生長、分化、遷移、免疫反應(yīng)等過程,可以受到細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、缺氧等激活[19]。MAPK 信號通路中以p38MAPK 信號通路與病理性瘢痕關(guān)系密切。Yang等[20]通過全基因組重測序研究發(fā)現(xiàn),p38MAPK 信號通路的相關(guān)基因MAPK4在瘢痕疙瘩中過度表達(dá),其與瘢痕疙瘩的類腫瘤生長特性密切相關(guān)。研究[21-22]指出MAPK4具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用,MAPK4敲除后可減輕急性肺損傷小鼠模型的肺部炎癥反應(yīng),MAPK4可能促進(jìn)了轉(zhuǎn)化生長因子β的升高。而在氣道瘢痕形成的過程中,局部損傷的氣管的炎癥細(xì)胞因子 (如轉(zhuǎn)化生長因子β、IL-6、IL-8 等)表達(dá)量也顯著升高,推測MAPK4可能通過激活炎癥因子的方式促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白及α-SMA 的表達(dá),從而促進(jìn)氣道瘢痕的發(fā)生。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炓约癿 RNA 和蛋白表達(dá)水平的結(jié)果,均證實miR-127-3p可以直接與MAPK4 結(jié)合而抑制MAPK4 的表達(dá),提示miR-127-3p可能通過MAPK4 減輕氣道瘢痕的形成。

為了進(jìn)一步探究miR-127-3p在氣道瘢痕中的生物學(xué)作用,本研究采用miR-127-3p模擬物上調(diào)瘢痕成纖維細(xì)胞的miR-127-3p的表達(dá)水平,結(jié)果顯示上調(diào)miR-127-3p后,會抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖,且MAPK4、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白及α-SMA的表達(dá)水平均下降;當(dāng)抑制miR-127-3p時,MAPK4、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白及α-SMA表達(dá)水平有所上升。許多研究指出降解減少和合成過多的Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白可以導(dǎo)致增生性瘢痕的形成[23]。本實驗結(jié)果證明,過表達(dá)miR-127-3p可以抑制Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的分泌,從而抑制瘢痕的形成。同時,α-SMA 作為細(xì)胞骨架蛋白,是成纖維細(xì)胞收縮表型的典型標(biāo)志,是肌成纖維細(xì)胞所分泌的特性蛋白,成纖維細(xì)胞表達(dá)α-SMA后,激活轉(zhuǎn)化成肌成纖維細(xì)胞,是組織纖維化的早期表現(xiàn)[22]。本研究中上調(diào)miR-127-3p后α-SMA 降低,表明miR-127-3p可能通過阻止成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化導(dǎo)致α-SMA 分泌水平下降,從而減輕氣道瘢痕的形成。但本研究僅進(jìn)行了細(xì)胞實驗,對于miR-127-3p對氣道瘢痕的作用,在動物體內(nèi)實驗驗證有待深入研究;同時,本研究只對預(yù)測分?jǐn)?shù)最高的靶基因MAPK4進(jìn)行了驗證,miR-127-3p對瘢痕機(jī)制的影響可能通過多個靶基因共同作用,需進(jìn)一步進(jìn)行確認(rèn)。

綜上所述,miR-127-3p 在人氣道瘢痕組織中呈低表達(dá),對成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用,并且可靶向下調(diào)MAPK4的表達(dá),同時miR-127-3p還具有抑制成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白的作用。通過miR-127-3p的研究有助于對氣道狹窄的治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突