玉米加工副產品黃曲霉毒素的檢測

范紅霞

諸城興貿玉米開發有限公司 山東諸城 262200

1 黃曲霉毒素的危害

黃曲霉毒素對人和讀物健康的危害均與黃曲霉毒素抑制蛋白質的合成有關。研究發現，黃曲霉毒素具有很強的致癌性、致突變性和致畸性，能使魚類、禽類、家畜和靈長類動物誘發實驗性肝癌，只要病變為肝臟出血、壞死、膽管增生、肝硬化等。經大量的流行病學調查證實，黃曲霉毒素的高攝入量和人類肝癌的發病率密切相關。

2 玉米加工副產品黃曲霉毒素檢測方法綜述

目前黃曲霉毒素檢測常用的方法如下幾種：

2.1 薄層層析法（TLC）

TLC法是針對不同的樣品，用適宜的提取溶劑將霉菌毒素從樣品中提取出來，經柱層析凈化，再在薄層板上層析展開、分離，利用霉菌毒素的熒光性，根據熒光斑點的強弱與標準比較測定其最低含量。

2.2 色譜法

色譜法包括薄層色譜，氣相色譜、液相色譜等，一直是最重要的霉菌毒素的化學分析方法?，F在比較普遍的霉菌毒素的分析方法還是液相色譜法，包括液相色譜-質譜聯用技術。

2.3 熒光光度法（IAC/SAB）

試樣經過甲醛水提取，提取液經過過濾、稀釋后，濾液經過含有AFT特殊抗體的免疫親和柱凈化。此抗體對AFT具有專一識別能力。AFT鍵合在分離柱中的抗體上。用蒸餾水將免疫親和柱上雜質除去，以甲醇通過分離柱洗脫。加顯色劑于專用的熒光劑測定樣品中法AFT含量。

2.4 酶聯免疫法（ELISA）

ELISA法也是近年來研究出來的一種較為新穎的方法。是將抗體抗元反應的特異性和酶與底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫分析技術。樣品中的黃曲霉毒素B1與定量特異抗體反應，多余的游離抗體與固相包被抗原結合，加入酶標記物和底物后顯色，與標準線比較計算含量。

在這里我主要是研究黃曲霉毒素B1的ELISA方法。

3 實驗部分

3.1 ELISA檢測玉米副產品中黃曲霉毒素B1

3.1.1 設備與試劑

酶標儀（MK3芬蘭雷勃公司），高速萬能粉碎機（天津泰斯特），回旋式振蕩器（HY-5），微量移液管（芬蘭雷勃公司），分析天平（AL204型，量程10mg-210g，梅特勒.托利多公司），醫用離心機（江蘇欣康醫療），量筒25ML，三角瓶100mL，移液管25ML，離心管10ML，定性濾紙，，ELISE測試試劑盒（上海千慕生物技術有限公司）甲醇（AR級國藥試劑公司），NaCl（AR級）

3.1.2 樣品采集

本實驗所用樣品系于2021年3月17日從車間所取，根據國家取樣標準在，采集有代表性的樣品。

參照有關文件的方法進行樣品制備，將樣品粉碎后過篩，充分混合。取蛋白粉、噴漿玉米皮、胚芽餅各5克于100ml的容量瓶中，并添加1gNaCl，25ML70%甲醇水溶液，充分震蕩3分鐘；取10ML濾液以3500xg離心5分鐘，收集上清液。即為待測樣。

3.1.3 ELISA檢測步驟

試劑的準備。從冰箱中取出黃曲霉毒素B1酶聯免疫試劑盒，平衡至室溫，并在室溫下保持至少1小時。

分析步驟：①預先安排好實驗流程，記錄好每個標準品/樣品的位置；②添加100ul酶耦合劑到每個預混合孔；③添加50ulAFB1系列標準溶液（0ppb，1ppb，5ppb，20ppb，40ppb）和樣品到相應的預混孔；④用微量移液槍，混合每個預混合孔中的內容物，立即將100ul轉移到相應的抗黃曲霉毒素B1抗體包被的微孔中；⑤于室溫孵育10分鐘；⑥洗板孵育結束后倒掉孔中的液體、用稀釋后的稀釋液填滿微孔，倒掉微孔中的液體，重復清洗三次；將微孔板倒扣在濾紙上并輕輕敲打，清除殘留的液滴；⑦發展添加100ul發展液到每個微孔中，徹底混合幾秒鐘；⑧室溫條件下孵育5分鐘；⑨添加50ul終止液到每個微孔中，并徹底混合幾秒中；10、在450nm處測定吸光度值，在15分鐘內度數[1]。

4 結果與分析

將每個標準品/樣品的吸光度值圖一標準0（B0）的吸光度并乘以100、因此，最大結合（B0）等于100%，吸光度值以百分比表示；標準品吸光度值（或樣品）/零標準品吸光度值×100=B/B0（%）根據每個標準品的B/B0值和黃曲霉毒素B1標準品濃度繪制曲線；將每個樣品的B/B0值插入校準曲線中得到相應濃度。標準品濃度已經考慮了樣品稀釋因子，對于所做樣品，如果提取物稀釋5倍，則將所得濃度值乘以5[2]。

5 標準曲線

圖1 Aflatoxin B1（PPb）

6 結果評估

樣品序號 ID 吸光度值（mean）（CV）B/B0（%）計算（ppb） *= ppb（%）1 蛋白粉 1.187 0.0 78.8 1.3 5.0 6.7 2 噴漿玉米皮 0.925 0.0 61.4 3.3 5.0 16.4 3 胚芽餅 1.085 0.0 72 2.0 5.0 9.9 4 蛋白粉 1.116 0.0 74.1 1.8 5.0 8.8 5 噴漿玉米皮 0.712 0.0 47.3 6 5.0 30.0 6 胚芽餅 0.484 0.0 32.1 11.8 5.0 58.8

根據試劑盒給定的參數，所測樣品均在數據要求的范圍內，本次實驗結果有效。

由于原料的不同，所測得的數據會得出不同的結果。