堿提甘蔗皮多糖提取工藝、初步結(jié)構(gòu)及其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

王萱萱，劉春宇，謝貝昱，張淑淑，王丹陽，朱振元

天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457

0 引言

【研究意義】甘蔗（Saccharumofficinarum）為禾本科（Poaceae）甘蔗屬（Sacchrum）的一種多年生高大實(shí)心草本高光效C4植物，是重要的糖料與生物能源作物，主要生產(chǎn)國(guó)是巴西、印度和中國(guó)等國(guó)家[1]。甘蔗皮作為一種廢棄物，約占甘蔗本身重量的20%，富含纖維、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、蔗糖、天然色素等物質(zhì)[2]。然而，大多數(shù)甘蔗皮被當(dāng)作加工副產(chǎn)物丟棄，造成一定的資源浪費(fèi)，開展甘蔗皮堿提多糖結(jié)構(gòu)和活性研究，旨在為甘蔗皮多糖的綜合開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，對(duì)廢棄資源的再利用有著重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，以甘蔗皮為原料的研究主要集中在甘蔗皮黃酮、多酚及花色苷的提取分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗氧化活性等方面。周慧芳[3]采用超聲輔助法提取甘蔗皮黃酮，通過有機(jī)溶劑萃取、聚酰胺層析、葡聚糖凝膠色譜和制備液相色譜分離得到黃酮單體，通過質(zhì)譜、核磁、紅外光譜分析了黃酮單體的結(jié)構(gòu)，此外，甘蔗皮黃酮表現(xiàn)出良好的抑菌活性、抗氧化活性和降血糖活性；陳純[4]采用超聲波法提取甘蔗皮多酚，利用X-5樹脂對(duì)甘蔗皮多酚進(jìn)行純化，通過DPPH·自由基清除法和FRAP法兩種體系表明甘蔗皮多酚具有一定的抗氧化活性，隨著多酚濃度的升高，抗氧化能力越強(qiáng)；閆懷峰等[5]采用溶劑法提取甘蔗皮中的花色苷，并用輔色劑對(duì)花色苷的輔色作用進(jìn)行了研究。植物多糖含有大量的細(xì)胞壁多糖，采用適當(dāng)濃度的堿溶液可從熱水浸提的殘?jiān)欣^續(xù)提取出細(xì)胞壁結(jié)合多糖，使不溶性多糖轉(zhuǎn)化為可溶性多糖，從而提高多糖得率。田洛等[6]采用堿提取法提取黃芪多糖，黃芪多糖的提取率達(dá)到水提取法的3.25倍。此外，研究表明堿性溶液提取的多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒和抗衰老等多種生物活性。焦中高等[7]研究表明，堿提紅棗多糖是一種優(yōu)良的自由基清除劑和α-葡萄糖苷酶及透明質(zhì)酸酶抑制劑，利用堿提工藝可提高紅棗資源的利用率，并獲得高活性的紅棗多糖。【本研究切入點(diǎn)】目前，甘蔗皮水溶性多糖、黃酮、多酚和花色苷有一些研究，但堿溶液提取甘蔗皮多糖的提取工藝條件、結(jié)構(gòu)表征及其生物活性尚鮮有報(bào)道，堿提甘蔗皮多糖的得率、構(gòu)效關(guān)系有待研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】以甘蔗皮為原料，利用單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)確定堿提甘蔗皮多糖的最佳提取工藝；綜合運(yùn)用GC-MS、FT-IR等現(xiàn)代儀器分析技術(shù)對(duì)堿提甘蔗皮多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；并以體外α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)堿提甘蔗皮多糖降血糖效果，旨在為甘蔗皮多糖在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)加工等領(lǐng)域的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2019—2020年在天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

黑皮甘蔗，購自海南省三亞市，保存于實(shí)驗(yàn)室。單糖標(biāo)準(zhǔn)品（L-鼠李糖，D-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖）、α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖水合物、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡糖糖苷（4-Nitrophenylβ-D-glucopyranoside）購自美國(guó) Sigma公司；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（T-10、T-40、T-70、T-110、T-500、T-2000）購自北京索萊寶科技有限公司；試驗(yàn)用其他有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent-1260 infinity Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng)，美國(guó)安捷倫公司；Scion TQ氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國(guó)布魯克公司；IS 50傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)尼高力儀器公司；SP-2102UV紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；RE-52AA真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 堿提甘蔗皮多糖的提取工藝 甘蔗→清洗后去皮→烘干→粉碎→過篩→稱取粉末→氫氧化鈉堿溶液提取→多糖浸提液→濃縮→乙醇沉淀→離心→甘蔗皮粗多糖→除蛋白→除色素→堿提甘蔗皮多糖。

1.3.2 操作要點(diǎn) 將新鮮的甘蔗清洗干凈后去皮，置于60℃烘箱內(nèi)烘干。使用粉碎機(jī)將甘蔗皮粉碎，過60目篩，備用。精確稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照料液比1﹕50（g·mL-1）加入6%氫氧化鈉溶液，于35℃恒溫水浴提取1 h，沉淀物重復(fù)以上操作2次，于4 000 r/min離心15 min后，加入HCl溶液調(diào)節(jié)至pH 7.0，收集上清液，即多糖浸提液。將上清液在60℃條件下濃縮至一定體積后，按照1﹕4（v﹕v）的比例加入無水乙醇，4℃醇沉靜置過夜。4 000 r/min離心15 min后收集沉淀，得到堿提甘蔗皮粗多糖[8]。粗多糖采用Sevge法除蛋白、AB-8樹脂除色素進(jìn)行純化[9]，冷凍干燥后，得到精制的堿提甘蔗皮多糖，命名為SPAP。

1.3.3 堿提甘蔗皮多糖提取單因素試驗(yàn)

（1）提取溫度對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照氫氧化鈉濃度2%，料液比1﹕30（g·mL-1），提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)1次，考察不同提取溫度（15、25、35、45和55℃）對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（2）NaOH溶液濃度對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，料液比1﹕30（g·mL-1），提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)1次，考察不同NaOH濃度（2%、4%、6%、8%和10%）對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（3）料液比對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，氫氧化鈉濃度6%，提取時(shí)間1 h，提取次數(shù)1次，考察不同料液比（1﹕20、1﹕30、1﹕40、1﹕50和1﹕60 g·mL-1）對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（4）提取時(shí)間對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，氫氧化鈉濃度6%，料液比1﹕50（g·mL-1），提取次數(shù)1次，考察不同提取時(shí)間（1、1.5、2、2.5和3 h）對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

（5）提取次數(shù)對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響

稱取甘蔗皮粉末1.00 g，按照提取溫度35℃，氫氧化鈉濃度6%，料液比1﹕50（g·mL-1），提取時(shí)間1 h，考察不同提取次數(shù)（1、2、3、4和5 次）對(duì)堿提甘蔗皮多糖提取率的影響。

1.3.4 堿提甘蔗皮多糖Box-Behnken中心組合試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，選取提取溫度、NaOH濃度、料液比、提取次數(shù)4個(gè)因素為自變量，以堿提甘蔗皮多糖得率為響應(yīng)值，運(yùn)用Design Expert 8.0.7軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，對(duì)堿提甘蔗皮多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。Box-Behnken中心組合試驗(yàn)各因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 堿提甘蔗皮多糖基本成分的測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[10]測(cè)定堿提甘蔗皮多糖中性糖的含量，分別精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg·mL-1）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于具塞試管中，加入蒸餾水補(bǔ)足至1 mL；然后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的苯酚溶液，再依次垂直滴加5 mL濃硫酸，用渦旋混合儀充分振蕩混合，常溫靜置15 min至冷卻，在λ＝490 nm處測(cè)定其吸光度值。經(jīng)回歸分析得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.0411x+0.0064，R2=0.9992（其中，y代表吸光度，x代表葡萄糖濃度）。采用硫酸-咔唑法[11]測(cè)定堿提甘蔗皮多糖糖醛酸的含量，分別精確吸取半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)液（0.1 mg·mL-1）0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL置于10 mL具塞試管中，加入蒸餾水補(bǔ)足至1 mL；在冰水浴中向各管加入5 mL硼砂-硫酸溶液，混勻后沸水浴中加熱5 min，取出后冷卻至室溫；再加入 0.1%咔唑溶液 0.2 mL，渦旋30 s，沸水浴5 min，冷卻后測(cè)定各管在523 nm處的吸光度。經(jīng)回歸分析得到半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=8.5169x-0.0097，R2=0.9990（其中，y代表吸光度，x代表半乳糖醛酸濃度）。分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算中性糖及糖醛酸含量，多糖提取得率按照公式計(jì)算：

式中：m為堿提甘蔗皮粗多糖質(zhì)量（g），M為甘蔗皮粉末質(zhì)量（g）。

1.3.6 堿提甘蔗皮多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析

1.3.6.1 堿提甘蔗皮多糖的含量測(cè)定 精確稱取精制后的堿提甘蔗皮多糖，將其配成濃度為 1 mg·mL-1的溶液，按照1.3.5中所述方法測(cè)定并計(jì)算堿提甘蔗皮多糖的含量。

1.3.6.2 堿提甘蔗皮多糖的純度鑒定 將精制后的多糖用蒸餾水溶解配制成濃度為1 mg·mL-1的溶液，利用紫外分光光度計(jì)（SP-2102UV）在波長(zhǎng)為 190—400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描。

1.3.6.3 堿提甘蔗皮多糖分子量分布的測(cè)定（HPLC）采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）對(duì)多糖樣品分子量進(jìn)行測(cè)定[12]。精確稱取樣品2 mg溶于1 mL超純水，過水膜后，取20 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱：TSK gel G4000 PWXL column（7.8 mm×300 mm）；檢測(cè)器：折射率檢測(cè)器（RID）；流動(dòng)相：超純水；流速：0.6 mL·min-1；柱溫：35℃。以葡聚糖T-2000、T-500、T-110、T-70、T-40和T-10（分子量分別為 2 000 000、500 000、110 000、70 000、40 000和10 000 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)分子量及保留時(shí)間繪制分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6.4 堿提甘蔗皮多糖的紅外光譜分析（FT-IR）將干燥的多糖樣品1 mg與干燥的KBr 150 mg混合，研磨均勻后利用壓片機(jī)將其壓成透明薄片。利用傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo Nicolet Corporation，USA）進(jìn)行掃描[13]。掃描范圍：400—4 000 cm-1，分辨率：4 cm-1，掃描次數(shù)：16。

1.3.6.5 堿提甘蔗皮多糖的單糖組成分析 堿提甘蔗皮多糖的單糖組成參考ZHANG等[14]的氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）測(cè)定。稱取樣品（5 mg）置于具塞試管中，用2 mL 2.0 mol·L-1TFA（三氟乙酸）在110℃水解 3 h。水解后，向全水解樣品中加入鹽酸羥胺（10 mg），內(nèi)標(biāo)物肌醇六乙酸酯（2 mg）和吡啶（0.5 mL），振蕩均勻后，于90℃油浴鍋中反應(yīng)30 min。冷卻后，繼續(xù)加入醋酸酐（0.5 mL）于90℃油浴下反應(yīng)30 min。得到的糖精乙酸酯衍生物用N2吹干，加入1 mL二氯甲烷重新溶解，取0.2 μL進(jìn)行氣質(zhì)色譜分析。色譜條件：色譜柱：HP-5MS（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）；檢測(cè)器：氫火焰電離檢測(cè)器（FID）；載氣：N2；流速1.0 mL·min-1；程序升溫：100℃保持 2 min→260℃（10℃·min-1）→260℃保持3 min。6種單糖（L-鼠李糖，D-阿拉伯糖，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖）處理方式同上。

1.3.7 堿提甘蔗皮多糖的α-葡萄糖苷酶抑制作用α-葡萄糖苷酶抑制活性的反應(yīng)體系參照 LIU等[15]的方法，并略作改進(jìn)。分別配制 0.1 moL·L-1磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH 6.8）、0.6252 mmoL·L-1PNPG 溶液（PBS 溶解）、1 U·mL-1α-葡萄糖苷酶酶液（PBS溶解）以及 0.1 moL·L-1Na2CO3溶液（PBS溶解）；待測(cè)樣品用蒸餾水溶解，采用倍比稀釋法稀釋至濃度為4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg·mL-1的待測(cè)液。用阿卡波糖作為陽性對(duì)照，同樣將濃度稀釋為 4、2、1、0.5、0.25 和 0.125 mg·mL-1。取40 μL的樣品，加入到96孔板中，然后加入40 μL的酶液（1 U·L-1），混勻，于37℃黑暗中孵育10 min，加入20 μL的PNPG溶液，于37℃黑暗中孵育 30 min，最后加入 0.1 moL·L-1Na2CO3溶液100 μL結(jié)束反應(yīng)，于410 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，每組做3個(gè)平行。按照公式計(jì)算抑制率，溶液具體加入量見表2。

表2 堿提甘蔗皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Experimental design of polysaccharide with alkaline-extracted from sugarcane peel on α-Glucosidase inhibition

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Design Expert 8.0.7軟件對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)分析、Origin 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與作圖，并利用SPSS 20.0軟件中的Duncan法進(jìn)行方差分析，以P<0.05表示顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溫度對(duì)甘蔗皮多糖提取的影響 不同提取溫度對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響如圖1所示，當(dāng)溫度在15—35℃，堿提甘蔗皮多糖得率隨著溫度升高而增加；當(dāng)提取溫度為35℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值5.86%；當(dāng)溫度超過35℃后，多糖得率反而下降。一定程度上升高提取溫度會(huì)增加樣品多糖的溶出，提高多糖得率，但是過高的提取溫度可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，致使多糖得率低[16]。因此，選擇提取溫度為35℃。

2.1.2 NaOH濃度對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 堿液濃度在2%—6%時(shí)，堿提甘蔗皮多糖得率隨堿液濃度升高而增加；當(dāng)NaOH濃度超過6%后，堿提甘蔗皮多糖得率反而下降，可能堿液濃度過高會(huì)破壞多糖結(jié)構(gòu)[17]；當(dāng)NaOH濃度為6%時(shí)，其多糖得率最高為6.82%（圖2）。綜合考慮各項(xiàng)因素，選擇NaOH濃度為6%效果最佳。

2.1.3 料液比對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 隨著料液比的增加，在 1﹕20—1﹕40（g·mL-1）范圍內(nèi)，堿提甘蔗皮多糖得率呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。當(dāng)料液比過低時(shí)，溶液多黏稠狀，細(xì)胞空化不完全，導(dǎo)致多糖提取不徹底；當(dāng)料液比過高時(shí)，會(huì)使得溶液體積過大，不易后續(xù)的分離操作并且浪費(fèi)資源[18-19]。當(dāng)料液比為1﹕50（g·mL-1）時(shí)，堿提甘蔗皮多糖得率出現(xiàn)峰值為6.82%（圖 3）。因此，選取料液比為 1﹕50（g·mL-1）最合適。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 在1.0—3.0 h內(nèi)，隨著提取時(shí)間的增加，曲線呈現(xiàn)一條直線，波動(dòng)較小，表明堿提甘蔗皮多糖得率基本不變，多糖得率約為7.5%（圖4）。其他條件一定，綜合考慮成本、資源利用等因素[20]，選擇提取時(shí)間為1 h。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響 提取次數(shù)為1—4次時(shí)，堿提甘蔗皮多糖得率與提取次數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)；當(dāng)提取次數(shù)為 4次時(shí)，多糖得率達(dá)到10.96%；當(dāng)提取次數(shù)大于4次，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率沒有顯著性變化（圖5）。因此，提取次數(shù)4次最優(yōu)。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化堿提甘蔗皮多糖提取工藝

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（A）、NaOH濃度（B）、料液比（C）、提取次數(shù)（D）為自變量，以甘蔗皮堿提多糖得率為響應(yīng)值（Y），設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)方法，共包括29組試驗(yàn)方案，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及數(shù)值分析 利用Design Expert軟件對(duì)表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到堿提甘蔗皮多糖提取率的回歸方程：

Y=10.87+0.093A-0.066B+0.042C+0.076D+0.037AB+（2.500E-003）AC+0.083AD+0.20BC-0.30BD+ 0.012CD-0.11A2-0.15B2-0.11C2-0.28D2

由表 4可見該模型顯著（P＜0.0001），失擬項(xiàng)P=0.0641＞0.05，不顯著。R2=0.9048，表明90%的數(shù)據(jù)可以用這個(gè)方程解釋。各因素影響堿提甘蔗皮多糖得率的主次順序?yàn)?A＞D＞B>C，即提取溫度＞提取次數(shù)＞NaOH濃度＞料液比。失擬項(xiàng)各項(xiàng)數(shù)據(jù)分析表明該模型失擬不顯著，因此該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面。另外，由表4和圖6分析可知，交互因素中，BC、BD 交互作用顯著，A2、B2、C2和D2均達(dá)到顯著。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)分析得到堿提甘蔗皮多糖得率的最佳條件為：提取溫度 37.52℃，NaOH濃度5%、料液比為46.69 mL·g-1，提取次數(shù)為4.72次，因此，為避免資源浪費(fèi)以及實(shí)際試驗(yàn)操作的方便，將堿提甘蔗皮多糖得率的最佳條件修改為提取溫度37℃，NaOH濃度5%、料液比為46 mL·g-1，提取次數(shù)為 4次，相應(yīng)提取液中甘蔗皮多糖含量為10.98 mg·g-1。在修正后的最佳條件下重復(fù)3次平行試驗(yàn)，得到甘蔗皮多糖含量平均值為10.84%，與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.28%，說明模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)實(shí)際值符合度較高，該回歸模型參數(shù)合理，能真實(shí)反映各因素對(duì)堿提甘蔗皮多糖得率的影響。

表4 方差表分析Table 4 Analysis of variance table

2.3 堿提甘蔗皮多糖的結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 堿提甘蔗皮多糖的分子量測(cè)定 采用高效凝膠滲透色譜法和高效液相色譜法對(duì)多糖的分子量分布進(jìn)行檢測(cè)。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子質(zhì)量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，得到以葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程y=-0.3395x+9.2104（y=lgMw，x=Rt），R2=0.9953。如圖7所示，經(jīng)除色素、除蛋白后的堿提甘蔗皮多糖高效液相色譜圖為單一峰，說明分子量相對(duì)均勻[21]。經(jīng)檢測(cè)，SPAP中性糖含量為（86.54±0.98）%，糖醛酸含量為（2.82±0.28）%。將多糖的出峰時(shí)間（t=8.039 min）代入回歸方程，計(jì)算得 SPAP的分子量為 3.03×103kD。張斌[22]研究表明，甘蔗滓水提多糖主要由兩個(gè)組分組成，分子量分別為1.93×104Da和7.523×103Da，這些差異表明甘蔗不同部位及不同提取方式等會(huì)引起多糖間分子量的極大差異。

2.3.2 多糖純度的鑒定 堿提甘蔗皮多糖 SPAP的紫外-可見光全波長(zhǎng)掃描結(jié)果如圖8所示，SPAP在260和280 nm處基本無吸收峰，表明多糖中基本不含蛋白和核酸[23]。

2.3.3 單糖組成分析 SPAP經(jīng)TFA降解，吡啶和乙酸酐衍生化后進(jìn)行GC-MS分析。如圖9所示，混標(biāo)中1—7的出峰順序依次代表鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和內(nèi)標(biāo)肌醇六乙酸酯。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)堿提甘蔗皮多糖水解樣品中的色譜峰進(jìn)行定位，并按照mi=Ai·ms·f/As公式計(jì)算樣品中各單糖的含量及比例（Ai、As分別代表待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積；mi、ms分別代表待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量；f為相對(duì)校正因子，計(jì)算公式：f=（m0/As）/（mi/A0），A0為標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積，m0為標(biāo)準(zhǔn)單糖組分的質(zhì)量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量）[24]。從圖中可以看出，SPAP主要由阿拉伯糖、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中木糖為主要成分。經(jīng)計(jì)算，SPAP中鼠李糖﹕阿拉伯糖﹕木糖﹕甘露糖﹕葡萄糖﹕半乳糖的摩爾比為0.47﹕5.75﹕15.47﹕1.00﹕3.22﹕2.32。

2.3.4 堿提甘蔗皮多糖的紅外光譜分析 采用 KBr壓片法對(duì)SPAP進(jìn)行FT-IR分析，在4 000—450 cm-1范圍內(nèi)的紅外光譜如圖10所示。在3 404.708 cm-1處有一寬峰，是多糖特征的-OH和水的O-H鍵之間的伸縮振動(dòng)引起；2 920.663 cm-1處為C-H伸縮振動(dòng)[25]；1 632.447 cm-1處有一強(qiáng)吸收峰，是由-COOH或-CO基團(tuán)的C=O非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起，表示含有醛基-CHO，一般糖分子結(jié)合水在此區(qū)域都有吸收峰[26]；1 420.798 cm-1周圍的吸收峰是C-H的變角振動(dòng)，以上4處為多糖的特征吸收峰[27]。1 152.741 cm-1、1 072.710 cm-1、1 043.783 cm-13處特征吸收峰表明SPAP中含有吡喃型糖苷鍵，可能存在α-(1→6)糖苷鍵；897 cm-1附近的吸收峰表示SPAP中存在β型糖苷鍵[28]。FT-IR結(jié)果表明，SPAP中的單糖是吡喃糖基型，可呈現(xiàn)α或β構(gòu)型。

2.4 堿提甘蔗皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

當(dāng)樣品濃度由 0.125 mg·mL-1增加到 4.00 mg·mL-1，抑制率由28.52%上升至78.31%，抑制曲線呈現(xiàn)先上升后逐漸平緩的趨勢(shì)，說明SPAP對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用存在劑量依賴性。與陽性對(duì)照阿卡波糖相比，樣品SPAP雖不及阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，但在 4.00 mg·mL-1時(shí)，抑制率達(dá)到78.31%，有較好的抑制作用（圖11）。IC50值越低，說明樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用越好，經(jīng)計(jì)算，阿卡波糖的IC50為0.178 mg·mL-1，堿提甘蔗皮多糖的IC50為0.3 mg·mL-1，SPAP的 IC50值略高于陽性對(duì)照。以上結(jié)果說明，堿提甘蔗皮多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶具有良好的抑制作用。

3 討論

據(jù)研究，多糖的提取工藝主要有超聲解法、酶解法及水提醇沉解法等[29-30]。堿解法是一項(xiàng)經(jīng)驗(yàn)成熟的多糖提取方法，能夠準(zhǔn)確、快速及穩(wěn)定地提取多糖。此外，堿性溶液提取可以使細(xì)胞壁結(jié)合多糖更好地轉(zhuǎn)化為可溶性多糖，該方法不僅可以提高多糖提取得率、縮短反應(yīng)時(shí)間，而且提取方法簡(jiǎn)便、設(shè)備要求低、原料可再利用，有利于生產(chǎn)。本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化堿提甘蔗皮多糖提取工藝，得到堿提甘蔗皮多糖最佳提取工藝。張斌[22]研究表明，甘蔗滓經(jīng)過脫脂、水提醇沉、Sevag法脫蛋白和透析后，得到甘蔗滓多糖的提取率為1.02%。肖亞聰[31]通過水提法、纖維素酶解法、木瓜蛋白酶解法、混合酶-超聲聯(lián)合法等不同提取方法提取甘蔗渣多糖發(fā)現(xiàn)，不同提取方法的多糖提取率有較大的差異，整體水平上看酶解-超聲聯(lián)合法都比單種酶酶解多糖提取率要高，酶解-超聲聯(lián)合法平均提取率約在 8%。本研究采用堿提多糖工藝方法與水提、酶解等提取方法相比，甘蔗皮多糖提取得率顯著提高，該工藝參數(shù)下，原料綜合利用率高，同時(shí)可有效提高產(chǎn)出和效率。

近年來，多糖由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性而備受關(guān)注[32]。據(jù)報(bào)道，許多堿性溶液多糖具有各種有用的生物學(xué)功能，例如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫活性和降血糖作用[33-36]。多糖的生物活性可能與結(jié)構(gòu)特征有關(guān)[37]，例如單糖組成及分子量分布。LI等[38]闡述了多糖的功能活性與分子量、單糖組成等幾個(gè)參數(shù)的綜合效應(yīng)有關(guān)。低分子量南瓜多糖具有較好的體外降血糖作用，原因可能是低分子量南瓜多糖中含有半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸，可以有效增強(qiáng)多糖與α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的結(jié)合。堿提甘蔗皮多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，其中木糖為主要成分。已有研究證實(shí)，含有更多阿拉伯糖或木糖殘基的多糖對(duì)α-葡糖苷酶表現(xiàn)出顯著的抑制作用。ZHANG等[14]用 5%NaOH溶液從甘草殘?jiān)刑崛　⒎蛛x、純化出一種中性多糖，該多糖由L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成，其中木糖含量最高，且對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出一定的抑制活性，與本研究結(jié)果一致。呂青青等[39]從麥麩獲得兩種多糖級(jí)分（WXA-1和 AXA-1），與 WXA-1相比，AXA-1的阿拉伯糖和木糖含量更高，這些原因可能導(dǎo)致AXA-1 比WXA-1具有更高的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。上述結(jié)果表明，木糖可能對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用。但堿提甘蔗皮多糖糖苷鍵連接方式等結(jié)構(gòu)特性與生物活性之間的關(guān)系及機(jī)理機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

堿提甘蔗皮多糖（SPAP）的最佳提取條件為提取溫度37℃、NaOH濃度5%、料液比1﹕46（g·mL-1）、提取次數(shù)4次，可有效利用原料、提高產(chǎn)出和效率；由 HPLC、FT-IR、GC-MS等方面初步闡述了 SPAP的結(jié)構(gòu)特性，同時(shí)SPAP對(duì)α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出良好的抑制作用，具有一定的降糖潛力。