四川養(yǎng)豬場常見病毒性病原流行病學調(diào)查及疾病有效防控能力分析

鄔旭龍 ，林 華 ，肖 璐 ，王 印

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學院，四川 成都 611130；2.成都海關(guān)技術(shù)中心，四川 成都 610041；3.四川省畜牧科學研究院 動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066；4.四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130）

中國是養(yǎng)豬大國，我國生豬產(chǎn)業(yè)正向?qū)I(yè)化和規(guī)?；缆钒l(fā)展，即由當初農(nóng)戶散養(yǎng)為主體的市場格局轉(zhuǎn)變成當前的多種養(yǎng)殖規(guī)模并存的格局。在經(jīng)歷了自然淘汰、市場選擇和養(yǎng)殖重整后，尤其是近兩年受環(huán)境治理拆遷、非洲豬瘟疫情和國家生豬布局優(yōu)化調(diào)整的影響，傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式正加速向規(guī)模化和智能化飼養(yǎng)轉(zhuǎn)變[1]，散養(yǎng)和小規(guī)模養(yǎng)殖不斷退出，數(shù)量減少，大型規(guī)?；i場逐漸成為中國養(yǎng)豬業(yè)重要的新生力量，在未來的發(fā)展中，規(guī)模化和自動化的養(yǎng)豬模式必定成為國內(nèi)養(yǎng)豬生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。盡管我國養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)型升級進程明顯加快，但微型和小型養(yǎng)豬場在少數(shù)地區(qū)仍然存在，這些豬場大多飼養(yǎng)條件差，養(yǎng)殖水平低，防疫、消毒、隔離等措施不到位，甚至飼喂泔水，因此導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。某些規(guī)模化豬場在養(yǎng)殖過程中，因其飼養(yǎng)管理和疫病防控能力差，同樣存在多種疾病混合感染的情況，使豬場對疾病的預(yù)防和控制越來越困難。加之豬場在引種、購買和養(yǎng)殖等過程中，生豬及其產(chǎn)品長距離調(diào)運，增大了各種病原體的傳播及生豬疾病感染和發(fā)病的空間跨度，加劇了各種病原體在豬場間的傳播，嚴重影響豬群健康水平和生物安全體系，豬場對疾病的有效防控能力降低，從而進一步加大了豬場對新發(fā)和外來動物疫病感染的可能性[2-5]。由于一些新發(fā)疫病病毒的復(fù)制能力強、突變速率高、并且具有重配和重組的變異方式[6-7]，這些疾病不僅嚴重威脅我國生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟和生態(tài)安全，同時給人類和動物的健康以及社會穩(wěn)定帶來巨大威脅。

近年來通過流行病學的調(diào)查和實驗室監(jiān)測數(shù)據(jù)分析，我國豬場疾病流行現(xiàn)狀為：豬病毒性疫病感染增多逐漸成為豬傳染病的主體；傳染性疾病的種類變多并有逐年增多的趨勢；多種病毒性疾病的混合感染越來越嚴重；非典型性病例的數(shù)量不斷增多，疾病的臨床癥狀和流行特點相似，給病原確診帶來了很大的困難。在面臨大量樣品的多種疾病鑒別診斷時，單病原診斷技術(shù)在未來的發(fā)展中已經(jīng)很難滿足臨床檢測的需要，而準確快速鑒別診斷病原對于制定治療和用藥方案、控制傳染病的流行具有重要意義。因此，更加高效率、自動化、高通量的檢測方法，可同時檢測多種豬病原體，為快速診斷和大批量樣品檢測提供新平臺。該研究通過高通量檢測方法對豬場病毒性疾病進行流行病學調(diào)查，通過檢測豬場病原的感染情況，從而反映和分析豬場對疾病的有效防控能力，可進一步為豬場對新發(fā)或外來動物疫病的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 毒株

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、日本乙型腦炎病毒（JEV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細小病毒（PPV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）陽性毒株來源于商品化疫苗，由四川農(nóng)業(yè)大學動物檢驗檢疫實驗室保存。

1.2 主要儀器

梯度PCR儀購于美國Bio-Rad公司；QIAxcel Advanced全自動核酸毛細管電泳儀購于德國QIAGEN公司；臺式冷凍離心機、-80 ℃超低溫冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、NanoDrop 2000超微量分光光度計均購于Thermo Scientifi c。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR Mastermix、 病毒核酸提取試劑盒、DL2000 DNA Marker，購自天根生化科技（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自TaKaRa；瓊脂糖、GoldView染料，購自北京索萊寶科技有限公司，Multiplex PCR Kit，購自德國QIAGEN公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 臨床樣品

采集近年來四川不同地區(qū)25個養(yǎng)豬場臨床樣品共計426份，其中包括6個微型養(yǎng)豬場臨床樣品61份，8個中小型養(yǎng)豬場臨床樣品118份，11個規(guī)?；B(yǎng)豬場臨床樣品247份。臨床樣品包括脾臟、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟等組織器官，精液、血液和糞便。具體樣品信息見表1。

表1 臨床樣品信息 個

1.5 病原檢測方法

利用高通量檢測方法[8]毛細管電泳全自動核酸分析系統(tǒng)對不同養(yǎng)豬場采集的臨床樣品進行檢測。其中內(nèi)臟組織器官在混合剪樣研磨后提取其核酸進行檢測，以滿足不同病原在各器官中的分布和含量不同的檢測需要。而精液和血液樣品中可能無法檢測到腹瀉病毒，因此需對同批采集的豬的糞便或肛門拭子同時檢測，從而保障檢測結(jié)果的準確性。

1.6 豬場疾病有效防控能力分析

對不同養(yǎng)豬場重要豬病毒性疫病進行分子流行病學調(diào)查，通過臨床樣品的陽性檢出率及混合感染情況進行統(tǒng)計，根據(jù)檢測結(jié)果，從病原感染角度分析微型養(yǎng)豬場、中小型養(yǎng)豬場和規(guī)?；B(yǎng)豬場，三種不同規(guī)模豬場對疾病的有效防控能力，而進一步推測豬場對新發(fā)和外來動物疫病，例如PRRSV NADC30-like、ASFV（非 洲 豬 瘟病毒）和PCV3（豬圓環(huán)病毒3型）等疫病的防控能力和感染易感性，為不同豬場針對新發(fā)和外來動物疫病病原監(jiān)測提供參考。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豬場病原檢測結(jié)果

利用高通量檢測方法對不同養(yǎng)豬場采集的臨床樣品，進行9種豬重要病毒病原PRV、CSFV、FMDV、JEV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和PPV檢測，根據(jù)結(jié)果可知（表2），426份臨床樣品中，至少檢測到一種病原感染的陽性樣品數(shù)為234份，陽性檢出率為54.93%（234/426），表明四川養(yǎng)豬場感染病毒性病原情況已較為嚴重。對3種不同規(guī)模類型養(yǎng)豬場進行病原分子流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，微型養(yǎng)豬場的病原陽性檢出率最高，達到80%以上，中小型養(yǎng)豬場病原陽性檢出率為58.47%，規(guī)模化養(yǎng)豬場的病原陽性檢出率最低，為46.96%。在對不同樣品檢測中，組織器官的病原陽性檢出率較高，均在70%以上，其次為血液和糞便的混合樣品，而精液的陽性檢出率最低。分析原因可能是因為組織樣品和流產(chǎn)胎均采集于已死亡或者發(fā)病的豬群，而其他樣品包括血液和精液均采集于正常飼養(yǎng)的豬，其具有較高的飼養(yǎng)管理水平，因此陽性檢出率較低。

表2 不同規(guī)模豬場病原檢測結(jié)果

2.2 不同豬場病原感染情況分析

三種類型養(yǎng)豬場的病原檢測結(jié)果顯示（表3），豬場均普遍存在多種病原混合感染的情況，且較為嚴重，特別是微型養(yǎng)豬場，多重病原混合感染的陽性檢出率達到60%以上，遠遠高于單一病原的陽性檢出率，3種及以上不同病原的感染也較其他兩種豬場更為嚴重。多病原的混合感染以PCV2、PRRSV、PEDV、PRV最為常見，導(dǎo)致免疫抑制性疾病感染嚴重，使得豬群抵抗力和免疫力降低，為病原體的侵入和感染提供了條件，因此加大了其他傳染病感染和傳播的風險。

表3 不同豬場病原感染情況

2.3 豬場疾病有效防控能力分析

根據(jù)檢測結(jié)果統(tǒng)計豬場病原陽性檢出率和多病原混合感染情況，綜合分析來看，無論是病原的陽性檢出率，還是單一病原或多病原的混合感染復(fù)雜程度，都呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場＞中小型養(yǎng)豬場＞規(guī)?；B(yǎng)豬場的趨勢，表明微型養(yǎng)豬場病原感染情況最為嚴重，對疾病的防控效果也最差。中小型養(yǎng)豬場和規(guī)?；B(yǎng)豬場雖各項陽性檢出率有所下降，特別是多重病原混合感染有明顯降低，但病原的陽性檢出率仍較高，疾病防控形勢仍然不容樂觀，特別是PCV2和PRRSV免疫抑制類疫病的檢出率仍非常嚴重，使得豬場在面對新發(fā)和外來動物疫病PRRSV NADC30-like和ASFV傳播時，具有極高的感染風險。因此推測豬場對PRRSV NADC30-like和ASFV等外來與新發(fā)疫病的感染風險呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場＞中小型養(yǎng)豬場＞規(guī)?；B(yǎng)豬場的趨勢。

3 討論

隨著我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)化程度逐年提高，并呈加速增長趨勢，近年來在政策和行業(yè)發(fā)展要求之下，我國生豬養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展已經(jīng)進入了快速發(fā)展期，特別是在非洲豬瘟疫情和生豬復(fù)養(yǎng)發(fā)展的影響下，更加加速了我國生豬產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級的步伐[9]，生豬生產(chǎn)方式加快轉(zhuǎn)變，養(yǎng)殖綠色化、規(guī)模化優(yōu)勢明顯，規(guī)?；曫B(yǎng)模式將會代替?zhèn)鹘y(tǒng)的散養(yǎng)模式，具有非常好的發(fā)展前景。但在養(yǎng)殖過程中，仍然存在較多問題，許多養(yǎng)殖場生物安全和飼養(yǎng)管理措施不全，導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。因此該研究在進行豬場疾病分子流行病學調(diào)查的過程中，主要考慮從三種不同飼養(yǎng)管理和規(guī)模類型的豬場進行臨床樣品的采集，利用建立的高通量檢測方法對其進行檢測，能較全面了解四川省豬場疾病感染情況，為病原流行病學調(diào)查及疾病防控提供參考。

疾病的暴發(fā)和流行不僅對豬場造成嚴重經(jīng)濟損失，同時也是制約我國養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)發(fā)展的主要因素。近年來，豬場傳染病流行主要以病毒性疫病為主，因此該研究主要針對豬場常見的病毒性疾病進行分子流行病學調(diào)查，利用高效的高通量方法進行檢測，在面臨較大數(shù)量樣品的多項目檢測過程中具有明顯的優(yōu)勢，從結(jié)果分析可以看出，無論是病原的總陽性檢出率，還是多病原的混合感染情況，都呈現(xiàn)微型養(yǎng)豬場最高、中小型養(yǎng)豬場次之，規(guī)?；B(yǎng)豬場最低的趨勢，表明微型養(yǎng)豬場疾病感染情況最為嚴重，病原的陽性檢出率高達80%，表明微型養(yǎng)豬場在飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)管理和疫病防控等各方面的現(xiàn)狀，更容易造成疾病的發(fā)生和傳播。在病原感染中，混合感染情況非常嚴重，并且呈有增無減的流行趨勢，不但病原種類增多，而且流行具有普遍性，成為豬場疾病感染的主流。病原以PCV2、PRRSV、PEDV的感染最為常見，特別是PCV2和PRRSV的感染，已經(jīng)成為目前豬病中最為多發(fā)的病毒性疾病。

研究根據(jù)對不同豬場病原檢測結(jié)果，初步分析了豬場對疾病的有效防控能力，進而反映了在新發(fā)或外來動物疫病發(fā)生和傳播時，不同豬場的易感染性，推測其對新發(fā)和外來動物疫病發(fā)生的風險，可早期發(fā)現(xiàn)隱患，及時有針對性地采取策略和措施，有效提高防控效率和質(zhì)量，遏制疫病流行傳播，保障養(yǎng)豬業(yè)持續(xù)健康發(fā)展。該分析和推測是完全基于樣品病原檢出結(jié)果，而其余影響疾病發(fā)生的因素例如豬場飼養(yǎng)管理水平，免疫效果評價，外界環(huán)境變化等，這些防控措施的實施，最終都在疾病感染或病原陽性檢出率的結(jié)果中體現(xiàn)，無論豬場管理和防控措施做得再好，病原的監(jiān)測和臨床檢測結(jié)果最能表明豬場對疾病的有效防控綜合能力，從而為預(yù)防新發(fā)疫病的感染提供參考。另一方面，病原體是動物疫病傳播流行的根本，其他所有因素也是通過對生物學因素的作用而影響動物疫病的流行傳播[10]。通過分析結(jié)果可知，微型養(yǎng)豬場病原陽性檢出率最高，且多病原混合感染最為嚴重，表明微型養(yǎng)豬場對疾病的防控能力最差，推測其在新發(fā)或外來動物疫病的防控中面臨嚴峻形勢和挑戰(zhàn)。