核型分析和基因組拷貝數(shù)變異測序在187 例患者產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用

孫夏瑜，武堅(jiān)銳，盧洪涌，葉婷，王娜，薛慧琴

(山西省兒童醫(yī)院，山西省婦幼保健院，山西 太原 030013)

我國出生缺陷的發(fā)生率約5.6%，其中由于染色體數(shù)目異常、大片段缺失或重復(fù)及致病性基因組致病性拷貝數(shù)變異等遺傳學(xué)病因引起的占80%以上[1]。為了降低出生缺陷兒的出生率，產(chǎn)前篩查與診斷是重要的二級預(yù)防手段。目前采用母體血清學(xué)進(jìn)行產(chǎn)前篩查，篩查高風(fēng)險(xiǎn)者進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷，是國內(nèi)外進(jìn)行產(chǎn)前診斷的重要策略之一。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，染色體核型分析結(jié)合分子生物學(xué)診斷技術(shù)是目前最常采用的策略之一。染色體核型分析技術(shù)可以檢測染色體數(shù)目異常以及片段長度大于10 Mb的結(jié)構(gòu)異常，但不能分辨片段較小的染色體異常，且對于異常染色體片段來源的判斷存在困難[2]。基因組拷貝數(shù)變異測序(CNV-seq)可以檢測小片段的染色體變異，包括染色體的微缺失和微重復(fù)等異常，且具有成本較低、重復(fù)性好等優(yōu)勢[3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月—2020年6月在我院產(chǎn)前診斷中心或遺傳咨詢門診進(jìn)行羊水產(chǎn)前診斷且結(jié)果異常的孕婦187 例。這些孕婦產(chǎn)前診斷指證包括高齡、血清學(xué)唐氏篩查異常、超聲異常或無創(chuàng)產(chǎn)前檢查(NIPT)高風(fēng)險(xiǎn)等。所有孕婦均填寫知情同意書并簽字確認(rèn)，同時(shí)采用羊水細(xì)胞染色體核型分析和CNV-seq兩種方法進(jìn)行診斷。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 羊水細(xì)胞染色體核型分析

所有孕婦經(jīng)B超確定孕周，了解胎盤位置、羊水量，確定穿刺部位，在無菌條件下經(jīng)腹壁行羊膜腔穿刺術(shù)。羊水樣本于37 ℃，5%二氧化碳濃度培養(yǎng)7～10 d后，常規(guī)制片，經(jīng)胰酶消化G顯帶染色分析。每例計(jì)數(shù)20 個(gè)分裂象，分析5～10 個(gè)核型。根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制》(ISCN 2016)來描述染色體核型分析結(jié)果。

1.2.2 羊水細(xì)胞CNV-seq檢測

羊水細(xì)胞CNV-seq檢測委托北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。結(jié)果分析參照國際基因組CNV多態(tài)性數(shù)據(jù)庫Decipher，UCSC Genome Browser，Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)，International Standards for Cytogenomic Arrays(ISCA)等以及相關(guān)文獻(xiàn)評估拷貝數(shù)變異測序(CNV)是否致病。檢測報(bào)告將嚴(yán)格按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)會指南進(jìn)行拷貝數(shù)變化(CNVs)分級，并確定臨床意義。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)前診斷結(jié)果異常孕婦的產(chǎn)前診斷指證

在187 例產(chǎn)前診斷患者中，>35 周歲的高齡孕婦63 例(33.69%)。唐氏篩查或NIPT任一高風(fēng)險(xiǎn)或者兩者均提示高風(fēng)險(xiǎn)患者119 例(63.64%)。只有超聲異常一項(xiàng)21 例(11.23%)。高齡、唐氏篩查或NIPT任一高風(fēng)險(xiǎn)或者兩者均提示高風(fēng)險(xiǎn)合并超聲異常20 例(10.70%)。

2.2 染色體核型分析結(jié)果

187 例羊水樣本，核型分析結(jié)果異常95 例，占50.8%。其中數(shù)目異常67 例(70.53%)，結(jié)構(gòu)異常17 例(17.89%)，嵌合核型11 例(11.58%)。數(shù)目異常包括13-三體綜合征1 例，18-三體綜合征9 例，21-三體綜合征37 例，性染色體異常20 例；結(jié)構(gòu)異常包括易位型21-三體綜合征1 例，X染色體長臂等臂3 例，部分缺失與重復(fù)11 例，羅氏易位2 例；嵌合核型包括嵌合型18-三體綜合征1 例，嵌合型21-三體綜合征3 例，性染色體異常嵌合6 例，嵌合型22-三體綜合征1 例(見表1)。

表1 187 例羊水染色體核型分析結(jié)果分類統(tǒng)計(jì)表

2.3 CNV-seq陽性結(jié)果分析

187 例羊水樣本中，CNV-seq結(jié)果評級為致病性109 例(58.29%)，其中13-三體異常1 例(0.92%)，18-三體異常10 例(9.17%)，21-三體異常41 例(37.61%)，22-三體異常1 例(0.92%)，性染色體異常28 例(25.69%)，微缺失微重復(fù)28 例(25.69%)。187 例羊水樣本，CNV-seq結(jié)果評級為可能致病性4 例，良性25 例，可能良性25 例，臨床意義不明24 例。

2.4 核型分析和CNV-seq結(jié)果比較

95 例羊水核型分析異常結(jié)果中，CNV-seq檢測提示致病性變異94 例，只有1 例染色體羅氏易位提示正常。11 例核型分析結(jié)構(gòu)異常樣本，CNV-seq檢測提示存在微缺失微重復(fù)結(jié)構(gòu)改變，且均為致病性變異。78 例CNV-seq檢測提示非致病性變異，核型分析均為正常。15 例CNV-seq檢測提示存在微缺失微重復(fù)結(jié)構(gòu)異常，核型分析均為正常。

3 討 論

染色體畸變包括染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，在臨床上通常表現(xiàn)為先天性智力低下、發(fā)育滯后、多發(fā)畸形、性發(fā)育不全、反復(fù)流產(chǎn)及不孕不育等。研究表明[4]，在出生缺陷患兒中，6.7%～21.4%是由染色體畸變引起的。目前，在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的實(shí)驗(yàn)室診斷中，染色體核型分析仍然是檢測染色體畸變的金標(biāo)準(zhǔn)，但其步驟相對復(fù)雜，對操作人員技術(shù)性要求較強(qiáng)，且分辨率較低。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，CNV-seq技術(shù)憑借其無需培養(yǎng)、具有檢測范圍廣、操作簡便、通量高及成本低等優(yōu)勢在流產(chǎn)物分析及產(chǎn)前診斷方面得到了較為廣泛的應(yīng)用[5]。

本研究中，孕婦接受產(chǎn)前診斷的指證依次是唐氏篩查或NIPT任一高風(fēng)險(xiǎn)或者兩者均提示高風(fēng)險(xiǎn)[119 例(63.64%)]、高齡[63 例(33.69%)]、單獨(dú)超聲異常[21 例(11.23%)]，高齡、唐氏篩查或NIPT任一高風(fēng)險(xiǎn)或者兩者均提示高風(fēng)險(xiǎn)患者合并超聲異常[20 例(10.70%)]。唐氏篩查或NIPT高風(fēng)險(xiǎn)，可能提示胎兒存在染色體異常。高齡可能會增加孕婦卵子老化、減數(shù)分裂過程中染色體不分離的概率[6]。本研究中，單獨(dú)超聲異常和合并超聲異常患者高達(dá)21.93%，提示超聲異常對染色體異常有非常重要的提示作用。這可能與染色體異常的胎兒大多合并有多種畸形或羊水過多、羊水過少等超聲異常有關(guān)。同時(shí)由于母血清篩查檢測會漏掉部分患者，在孕中晚期也會表現(xiàn)出胎兒超聲異常而進(jìn)行產(chǎn)前診斷。染色體核型分析可以準(zhǔn)確判斷染色體的數(shù)目異常，并判斷嵌合核型的情況。本研究中核型分析顯示數(shù)目異常73 例(76.84%)，嵌合核型11 例(11.58%)，與CNV-seq提示結(jié)果完全吻合。但在1 例核型分析結(jié)果為羅氏易位的患者中，CNV-seq檢測為正常。這與CNV-seq對于染色體平衡易位、倒位、插入等染色體結(jié)構(gòu)重排，以及不能檢測三倍體及多倍體，且無法檢測雜合性缺失(包括單親二倍體)等技術(shù)局限性有關(guān)[7]。染色體核型分析和CNV-seq在嵌合核型上的判斷較為一致。本研究中，核型分析顯示結(jié)構(gòu)異常11 例(11.58%)，CNV-seq檢測提示存在微缺失微重復(fù)結(jié)構(gòu)改變，且均為致病性變異。同時(shí)CNV-seq還檢測到15 例常規(guī)染色體核型分析為正常，但存在微缺失微重復(fù)的結(jié)構(gòu)異常。常規(guī)染色體核型分析可以看到大于10 Mb的結(jié)構(gòu)改變，而CNV-seq技術(shù)可以檢測出小于10 Mb片段的微小缺失與重復(fù)，可以彌補(bǔ)染色體核型分析的不足[8-9]。提示這兩種技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于臨床，取長補(bǔ)短，可減少因技術(shù)缺陷而導(dǎo)致漏診的情況。

綜上所述，不論何時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)前診斷指證，應(yīng)指導(dǎo)并建議孕婦進(jìn)行有針對性的產(chǎn)前診斷。CNV-seq檢測技術(shù)與現(xiàn)有的染色體診斷技術(shù)相結(jié)合，取長補(bǔ)短，可以減少因技術(shù)缺陷而導(dǎo)致漏診的情況，為臨床醫(yī)生提供更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。