替硝唑中雜質亞硝酸根的離子色譜法測定

潘波 劉麗娟 陳玉雙 鄭玉林

摘 要 目的：建立替硝唑原料藥中雜質亞硝酸根的測定方法。方法：采用離子色譜法測定，Dionex IonPac AS19，3.5 mm×250 mm色譜柱，KOH溶液梯度洗脫。結果：亞硝酸根與替硝唑可達到基線分離。亞硝酸根在0.025～1.000 mg/ml范圍內線性關系良好，檢測限（LOD）為0.010 mg/ml，定量限（LOQ）為0.025 mg/ml。結論：該法操作簡便，重現性好，結果準確可靠，可以用于替硝唑原料藥中基因毒性雜質亞硝酸根的測定。

關鍵詞 替硝唑 亞硝酸根 離子色譜法

中圖分類號：R978.19； R917 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2021）11-0078-03

Determination of impurity nitrite in tinidazole by ion chromatography

PAN Bo1*， LIU Lijuan2， CHEN Yushuang2， ZHENG Yulin2**

（1. Shanghai Sinopharm Holding Co.， Ltd.， Shanghai 200023， China； 2. Shanghai Fenglin Biological Technology Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of nitrite in tinidazole bulk drug. Methods： The ion chromatography （IC） was carried out on a Dionex IonPac AS19 column with KOH solution as gradient elution. Results： Nitrite could be completely separated from tinidazole and its stranded curve showed good linearization over the range of 0.025-1.000 mg/ml with detection limit 0.010 mg/ml and quantitation limit 0.025 mg/ml. Conclusion： This method is simple， reproducible and accurate and can be used for the determination of nitrite in tinidazole bulk drug.

KEy WORDS tinidazole； nitrite； ion chromatography

基因毒性雜質或遺傳毒性雜質（genotoxic impurity，GTI）可直接或間接損傷細胞中的DNA，誘發基因突變，具有致癌可能或者傾向。各國的法規機構，如人用藥品注冊技術要求國際協調會（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use，ICH）[1]、美國衛生與人類服務部 （U.S. Department of Health and Human Services，DHHS）[2]、歐洲藥品管理局（EMA）[3]等都對基因毒性雜質進行了明確要求，眾多制藥企業在新藥研發過程中也越來越關注基因毒性雜質的控制和檢測。

替硝唑是一種硝基咪唑類抗菌藥，用于治療各種厭氧菌感染，如敗血癥、骨髓炎、腹腔感染、盆腔感染、肺支氣管感染、肺炎、鼻竇炎、皮膚蜂窩組織炎、牙周感染及術后傷口感染，也可作為結腸直腸手術、婦產科手術及口腔手術等的術前預防用藥及腸道外阿米巴病、陰道滴蟲病、賈第蟲病、加得納菌陰道炎等的治療[4-6]。替硝唑的合成過程中用到硝酸，因此在替硝唑原料藥生產貯存過程中有可能生成亞硝酸根，須嚴格控制其毒理學關注閾值 （threshold of toxicological concern，TTC）[1]。ICH發布基因毒性雜質的最大攝取量為1.5 mg/d。

目前亞硝酸根的檢測方法通常有紫外分光光度法[7]，重氮偶聯反應雙模式方法[8]，離子色譜法[9-10]等。這些方法各有優缺點，但大多不僅費時費力，還會造成環境污染，如紫外分光光度法作為經典方法需要鹽酸萘乙二胺衍生，會引入重金屬污染物鎘，對環境危害很大。重氮偶聯反應雙模式方法，比色法專屬性差，會有離子干擾。離子色譜法[9]通過選擇高容量陰離子交換柱，增大進樣體積，以檢測水中的亞硝酸鹽，但通過增大本底量，容易引入氯離子和其他離子干擾；而武倫瑋等[10]報道的離子色譜改進方法，前處理復雜，需要加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀，會引入重金屬污染物。為了克服以上困難，本研究建立了簡便準確的離子色譜法，可準確靈敏地測定原料藥中基因毒性雜質亞硝酸根的含量。

1 材料和方法

1.1 儀器與試藥

AQ1200離子色譜儀、Dionex IonPac AS19色譜柱（3.5 mm×250 mm，4 μm）（賽默飛公司）。

原料藥（X制藥有限公司，含量99.9%、99.9%和100.1%，批號F-20190801、F-20190802和F-20190803）；國家標準樣品GSB 04-2839-2011、亞硝酸根單元素標準溶液（1 000 mg/ml），購自國家標準物質中心網。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制

1）工作標準液 精密移取亞硝酸根標準溶液0.5 ml或0.1 ml置10 ml容量瓶中，加超純水至刻度，搖勻，配制成亞硝酸根質量濃度為50 mg/ml或10 mg/ml的工作標準液1和2。

2）供試品溶液 精密稱量供試品0.25 g置于50 ml量瓶中，加入40 ml超純水，超聲（500 W，400 kHz）15 min并放冷至室溫，重復超聲操作5次后用超純水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液（2.5 mg/ml）。

3）線性溶液 精密量取工作標準液，用超純水配制成質量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 mg/ml的溶液，分別作為10%（定量限濃度）～ 400%限度水平檢測用對照品溶液。

4）準確度溶液 精密稱定供試品0.25 g 3份，分別置50 ml量瓶中，加入0.20、0.25、0.30 ml工作標準液1溶液，加入40 ml超純水，超聲15 min并放冷至室溫，重復超聲操作5次，用超純水稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液分別作為80%、100%、120%限度水平檢測用準確度溶液。

5）穩定性溶液 精密稱定供試品0.25 g，置50 ml量瓶中，加入0.25 ml工作標準液1溶液，加入40 ml超純水，超聲15 min并放冷至室溫，重復超聲操作5次，用超純水稀釋至刻度，搖勻，過濾，作為穩定性檢測用溶液。

1.2.2 色譜條件

淋洗液：KOH溶液；梯度程序見表1。流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量25 μl。

2 結果

2.1 線性

以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程為y=0.885 2x-0.006 5，相關系數r為0.999 9。結果表明，亞硝酸根在0.025～1.000 mg/ml范圍內線性關系良好，亞硝酸根檢測限（LOD）為0.010 mg/ml，定量限（LOQ）為0.025 mg/ml。

2.2 專屬性試驗

色譜圖顯示，空白溶液中亞硝酸根出峰處無干擾；供試品溶液中亞硝酸根出峰處無雜質干擾；0.250 mg/ml線性標準溶液連續6針進樣，峰面積RSD為0.2%。系統適用性（峰面積RSD≤2.0%）和專屬性均符合要求。

2.3 準確度試驗

按準確度試驗要求，對3個限度水平的準確度溶液進行離子色譜測定，計算得平均回收率（n=9）為97%，RSD為4.9%。符合回收率90%～110%、RSD<15%的要求。

2.4 精密度、重復性和穩定性試驗

按精密度、重復性和穩定性試驗要求，各制備6份供試品溶液進行離子色譜測定，其中精密度和重復性測試的RSD分別為4.8%和5.2%，符合<15.0%的要求。工作標準液2（10 mg/ml）及穩定性溶液于室溫放置8 h內較穩定。

2.5 樣品測定

從3批原料藥中取樣測定，計算得3批樣品中亞硝酸根檢出量分別為0.027、0.032 和0.036 mg/ml。

3 討論

亞硝酸根限度值：按亞硝酸鈉CPDB（潛在致癌物數據庫）毒性數據計算（TD50線性外推法）[9]，取大鼠的限度值167 mg/（kg·d），計算亞硝酸根限度，則替硝唑中亞硝酸根限度為55.68 mg/ml。按此標準判斷，所選用的原料中亞硝酸根檢出量遠遠小于限度。

本研究建立的方法與傳統的亞硝酸根測定方法（比色法、紫外分光光度法）比較，靈敏度更高，測試更準確。與已報道的離子色譜法相比，前處理簡單，環保，準確度和靈敏度更適用于藥物中的基因毒性雜質研究；本研究只對一種替硝唑的基因毒性雜質進行了研究，今后會根據合成路線，對多種基因毒性雜質開展研究。

參考文獻

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