芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

江友婭，陳 琦，張 露，高 雪,

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067；2.重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司，重慶 400061）

前期糖尿病也被稱為中度高血糖癥，主要包括葡萄糖耐量損傷和空腹血糖損傷，是處于正常人群和糖尿病人群之間的一種中間狀態(tài)。據(jù)2018年統(tǒng)計(jì)，全球的前期糖尿病患者約有四億七千萬(wàn)人[1]。研究顯示，前期糖尿病患者因心血管疾病、腎臟疾病和全因死亡率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血糖正常的人[2]。前期糖尿病在后期會(huì)發(fā)展為糖尿病，糖尿病屬于一種代謝性疾病，是由胰島素分泌受損或胰島素功能障礙所致，它對(duì)人類身體造成的危害僅次于心血管疾病和癌癥[3]。上世紀(jì)八十年代，世界上只有1.08億的糖尿病患者，截止到2015年，糖尿病人口數(shù)量已接近約4.22億，2011年聯(lián)合國(guó)非傳染性疾病問(wèn)題高級(jí)別會(huì)議后設(shè)定的全球防控目標(biāo)之一是到2025年，將成人糖尿病年齡標(biāo)準(zhǔn)化患病率的上升控制在2010年的水平，推測(cè)到2025年僅少數(shù)國(guó)家可達(dá)到該防控目標(biāo)[4]。2017年對(duì)中國(guó)糖尿病的發(fā)生率和相關(guān)死亡率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明中國(guó)的糖尿病發(fā)生率已從上世紀(jì)80年代的1%提高到現(xiàn)在約11%[5]；截止到2017年，國(guó)內(nèi)糖尿病患者數(shù)量已接近約1.1億人，患病率居世界第一[6]。由此可見，糖尿病已經(jīng)威脅到了全球的公共健康。抑制α-葡萄糖苷酶活性在治療糖尿病中起著重要作用，α-葡萄糖苷酶是與餐后寡糖分解有關(guān)的一種關(guān)鍵酶。目前，市場(chǎng)上還缺乏安全有效的降糖或預(yù)防糖尿病的功能性成分，如阿卡波糖等常見合成的α-葡萄糖苷酶抑制劑就具有腹脹、腹瀉以及皮膚過(guò)敏等副作用[7]，所以，現(xiàn)在亟需在天然產(chǎn)物中尋找和開發(fā)更加安全有效的降糖的功能性成分。

芫花素（Genkwanin，5,4'-二羥基-7-甲氧基黃酮）屬于黃酮類化合物[8]，來(lái)源豐富。我國(guó)天然藥物化學(xué)家曾廣方從瑞香科植物芫花的干燥花蕾中首次分離出芫花素[9]。此后，研究人員從迷迭香、益母草和黃芩等藥食兩用植物中分離得到芫花素[10?12]。根據(jù)研究結(jié)果顯示[13?14]，芫花素對(duì)調(diào)節(jié)免疫、緩解疼痛、抗炎和抗腫瘤等方面具有一定的作用。由此可以看出，研究芫花素在開發(fā)功能性分子方面具有一定的前景。但是，目前關(guān)于芫花素對(duì)預(yù)防糖尿病或前期糖尿病的研究還未見報(bào)道。

在本研究中，以芫花素為研究對(duì)象，研究其對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用和機(jī)理。前期采用體外酶活實(shí)驗(yàn)法和酶動(dòng)力學(xué)法檢測(cè)芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用及抑制類型，后期采用熒光猝滅法進(jìn)一步探究芫花素與α-葡萄糖苷酶之間的相互作用機(jī)理。為將芫花素開發(fā)為降糖功能性成分提供一定的理論依據(jù)，也為功能性食品和醫(yī)藥領(lǐng)域提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芫花素（純度≥98%） 普菲德生物有限公司；α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）、4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，99%） 美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖98%，TCI化成工業(yè)發(fā)展有限公司；二甲亞砜 分析純，重慶川東化工有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 分析純，成都市科龍化工試劑廠。

ALC-210.4電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；YP502N電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHSJ-3F實(shí)驗(yàn)pH計(jì) 寧波新芝生物科技股份有限公司；GZX-DH500-S-II電熱恒溫箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；VORTEX-5震蕩機(jī) 海門市其林貝爾儀器制造廠；SB-5200D超聲波清洗機(jī) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Infinite M2000酶標(biāo)儀 帝肯貿(mào)易有限公司；F-2500全波長(zhǎng)掃描式式多功能讀數(shù)儀、Finnpipette F3微型移液器 賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定參照Guilin等[15]的方法并加以改進(jìn)。將100 μL不同濃度（0.0625、0.125、0.25、0.5、0.75 mg/mL）的芫花素溶液與50 μL 0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液混合，然后分別加入50 μL 0.6 mg/mL底物（PNPG），混合物于37 ℃下孵育30 min，空白對(duì)照組使用磷酸緩沖液（0.01 mol/L pH=6.8）與二甲亞砜以1:1體積比混合的溶液替代樣品。吸光度值在405 nm下被檢測(cè)。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。抑制率計(jì)算如下：

式中：A空白表示不加芫花素的紫外吸光度值；A樣品表示加入芫花素反應(yīng)后體系的紫外吸光度值。

1.2.2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定根據(jù)郭時(shí)印等[16]的方法并加以改進(jìn)。固定α-葡萄糖苷酶的濃度為0.5 U/mL，選擇芫花素0、0.1、0.3 mg/mL三個(gè)濃度梯度，分別加入不同質(zhì)量濃度（0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mg/mL）的 底 物（PNPG），其中α-葡萄糖苷酶、芫花素和底物添加量分別為50、100和50 μL，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min，使用酶標(biāo)儀在405 nm處測(cè)定吸光度值。將反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/V）對(duì)底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)（1/[S]）作圖，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法研究芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型。

1.2.3 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用 采用楊麗珍等[17?18]的方法并加以改進(jìn)。分別移取0.5 U/mLα-葡 萄 糖 苷 酶 溶 液180 μL和2.6384×10?3mol/L芫花素溶液0、10、20、30、40、50、60、70、80 μL，使芫花素溶液終濃度為0、1.0148×10?4、2.0296×10?4、3.0443×10?4、4.0591×10?4、5.0739×10?4、6.0887×10?4、7.1035×10?4、8.1185×10?4mol/L，最后用磷酸緩沖液（0.01 mol/L pH=6.8）與二甲亞砜以1:1體積比混合的溶液將反應(yīng)體積補(bǔ)足至260 μL，作為α-葡萄糖苷酶-芫花素混合體系。在291、310 K兩個(gè)溫度下孵育30 min。將280 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，狹縫寬度設(shè)定為2 nm。掃描各樣品在298～370 nm處的熒光光譜。

1.2.4α-葡萄糖苷酶熒光猝滅類型的推斷 熒光猝滅包括靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅兩種[19]。芫花素和α-葡萄糖苷酶相互作用后，α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度變化可以由Stern-volmer方程說(shuō)明：

式中：F0表示α-葡萄糖苷酶在不加芫花素的情況下的熒光強(qiáng)度；F表示α-葡萄糖苷酶在加入芫花素后的熒光強(qiáng)度；Kq表示在猝滅過(guò)程中的速率常量，L/（mol·s）；τ0表示當(dāng)芫花素不存在時(shí)，熒光分子的平均壽命（10?8s）；[Q]表示芫花素的濃度，mol/L；Ksv表示熒光猝滅常量，L/mol。

1.2.5 熒光猝滅中結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的計(jì)算熒光猝滅時(shí)，假設(shè)酶上面有n個(gè)獨(dú)立的結(jié)合位點(diǎn)和小分子相互作用，則其結(jié)合常數(shù)、熒光強(qiáng)度、猝滅劑濃度和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)之間的關(guān)系能用雙對(duì)數(shù)方程表示為：

式中：KA表示復(fù)合物形成的結(jié)合常數(shù)；n表示猝滅過(guò)程中的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

1.2.6 芫花素與α-葡萄糖苷酶相互作用力類型的確定 靜電力、疏水作用力、范德華力和氫鍵等作用力能夠使酶與小分子或者生物大分子結(jié)合，從而形成復(fù)合物。Rahman等[20]研究表明不同的小分子藥物和生物大分子之間的主要作用力類型也不盡相同。因此兩分子之間的主要作用力類型可以根據(jù)兩者間相互作用的吉布斯自由能ΔG、焓變?chǔ)和熵變?chǔ)等熱力學(xué)參數(shù)來(lái)確定。相關(guān)計(jì)算如下：

式中：R為氣體常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；T1、T2分別為291、310 K；K1、K2分別291、310 K下的KA。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，圖表使用Origin 8.0繪制，并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外α-葡萄糖苷酶的抑制活性

如圖1所示，芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用隨著芫花素濃度的增加而明顯增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出劑量依賴性。在0.0625～0.75 mg/mL濃度范圍內(nèi)，芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖。

圖1 芫花素和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of genkwanin and acarbose on αglucosidase

2.2 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果

競(jìng)爭(zhēng)性抑制類型的動(dòng)力學(xué)方程見式（6），其動(dòng)力學(xué)特征主要為Km增大，Vmax不變，而由雙倒數(shù)圖可以得到Km和Vmax值，其中1/Vmax=縱軸截距，Km/Vmax=斜率[21]，如圖2所示，隨著芫花素質(zhì)量濃度的增加，反應(yīng)速率的倒數(shù)與底物濃度的倒數(shù)呈線性關(guān)系，三條線相交于縱軸，即Vmax基本不變；斜率隨著芫花素濃度的增加而增大，即Km逐漸增大，故可判定芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖2 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweave-Burk雙倒數(shù)圖Fig.2 Lineweaver-Burk plots of α-glucosidase inhibition by genkwanin

式中：V表示酶促反應(yīng)的速率，ΔA/min；Vmax表示酶促反應(yīng)的最大速率，ΔA/min；Km表示米氏常數(shù)，mol/L；[S]表示底物濃度，mg/mL。

2.3 熒光猝滅光譜分析

2.3.1 芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用 圖3和圖4分別為溫度為291和310 K時(shí)，不同濃度的芫花素存在時(shí)，0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶的熒光光譜變化情況。由圖3和圖4可知，當(dāng)芫花素的濃度低于8.1185×10?4mol/L時(shí)，α-葡萄糖苷酶的熒光強(qiáng)度隨著芫花素濃度的增加而逐漸降低，說(shuō)明當(dāng)芫花素的濃度增加時(shí)，體系中α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生了規(guī)律性的猝滅[22]，因此從另一方面也證實(shí)了芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶具有抑制作用[23?24]。加入了不同濃度的芫花素后，α-葡萄糖苷酶的最大發(fā)射波長(zhǎng)約為308 nm，不同濃度體系的最大發(fā)射峰都沒(méi)有發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移[25]，這說(shuō)明了不同濃度的芫花素與α-葡萄糖苷酶在相互作用時(shí)，僅僅影響了能發(fā)生熒光猝滅的α-葡萄糖苷酶殘基的微環(huán)境，表明芫花素與α-葡萄糖苷酶之間可能無(wú)明顯的共價(jià)鍵生成，從而使其最大發(fā)射波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生明顯的位移[26]。

圖3 291 K時(shí)芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響Fig.3 Effect of genkwanin on the fluorescence spectrum of αglucosidase at 291 K

圖4 310 K時(shí)芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的影響Fig.4 Effect of genkwanin on the fluorescence spectrum of αglucosidase at 310 K

2.3.2 熒光猝滅機(jī)理的推斷 將不同濃度（2.0296×10?4、3.0443×10?4、4.0591×10?4、5.0739×10?4、6.0887×10?4、8.1185×10?4mol/L）的芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光F0/F?1作圖，由圖5可知，F(xiàn)0/F?1和芫花素的終濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。Stern-volmer方程見1.2.4中的式（2），其中直線的斜率即為猝滅常量Ksv，直線的斜率也為Kqτ0，熒光分子的平均壽命τ0為10?8s，根據(jù)Stern-volmer方程計(jì)算的相關(guān)參數(shù)見表1。由表1可知，當(dāng)溫度升高時(shí)，猝滅常數(shù)Ksv有減小的趨勢(shì)，由此可以判斷出在芫花素的作用下，α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅[16]。與此同時(shí)，291和310 K下對(duì)應(yīng)的猝滅過(guò)程中的速率常數(shù)Kq分別為5.630×1013和5.582×1013L/（mol·s），遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于生物分子的最大碰撞擴(kuò)散速率常數(shù)（2.0×1010L/（mol·s）），而文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)速率常數(shù)Kq大于最大碰撞擴(kuò)散速率常數(shù)時(shí)為靜態(tài)猝滅[27]，因此可以進(jìn)一步判定芫花素和α-葡萄糖苷酶形成了無(wú)熒光或者熒光信號(hào)較弱的復(fù)合物而導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生了靜態(tài)猝滅。

圖5 不同溫度下芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅Stern-Volmer曲線Fig.5 Stern-Volmer curves of α-glucosidase fluorescence quenching by genkwanin

表1 不同溫度下芫花素與α-葡萄糖苷酶作用的相關(guān)參數(shù)Table 1 Reaction kinetic parameters between genkwanin and α-glucosidase at different temperatures

2.3.3 芫花素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 在不同的溫度下，以芫花素的終濃度（2.0296×10?4、3.0443×10?4、4.0591×10?4、5.0739×10?4、6.0887×10?4、8.1185×10?4mol/L）對(duì)應(yīng)α-葡萄糖苷酶熒光光譜的lg[Q]對(duì)lg（F0/F?1）做雙對(duì)數(shù)圖（如圖6），并進(jìn)行線性回歸，直線方程見1.2.5的式（3），其中斜率=結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，縱軸截距=lgKA，方程的相關(guān)參數(shù)見表2，由表2可知，在溫度291和310 K時(shí)，芫花素與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別約為2.8和2.2。同時(shí)，隨著溫度升高，芫花素與α-葡萄糖苷酶之間的結(jié)合常數(shù)KA值隨之減小，說(shuō)明溫度的升高不利于芫花素和α-葡萄糖苷酶之間所形成的復(fù)合物的穩(wěn)定性。

圖6 芫花素與α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的雙對(duì)數(shù)圖Fig.6 Double logarithmic diagram of fluorescence quenching between genkwanin and α-glucosidase

表2 芫花素與α-葡萄糖苷酶作用雙對(duì)數(shù)方程參數(shù)Table 2 Double logarithmic equation parameters of genkwanin interacted with α-glucosidase

2.3.4 芫花素與α-葡萄糖苷酶相互作用力類型 根據(jù)圖6求得291、310 K下的結(jié)合常數(shù)K1、K2以及通過(guò)方程可求得各項(xiàng)熱力學(xué)參數(shù)（結(jié)果見表3）。由表3可知在291、310 K下芫花素與α-葡萄糖苷酶的吉布斯自由能ΔG都為負(fù)數(shù)，說(shuō)明芫花素與α-葡萄糖苷酶復(fù)合物的形成是一個(gè)自發(fā)進(jìn)行的過(guò)程。焓變?chǔ)為負(fù)值，熵變?chǔ)為負(fù)值，說(shuō)明芫花素與α-葡萄糖苷酶之間所形成的復(fù)合物主要是通過(guò)氫鍵和范德華力相結(jié)合。

表3 芫花素與α-葡萄糖苷酶作用體系熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of genkwanin interacted with α-glucosidase

3 結(jié)論

本研究探討了芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用，體外酶活抑制實(shí)驗(yàn)表明了芫花素對(duì)α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制作用，抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，在0.0625～0.75 mg/mL之間，芫花素抑制α-葡萄糖苷酶較陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖更明顯。芫花素在氫鍵和范德華力為主要作用力下自發(fā)地與α-葡萄糖苷酶進(jìn)行結(jié)合，在溫度291和310 K時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別約為2.8和2.2，該復(fù)合物的形成使α-葡萄糖苷酶的熒光產(chǎn)生靜態(tài)猝滅。

綜上所述，芫花素可以較好地抑制α-葡萄糖苷酶的活性，具有較大的應(yīng)用潛力，該研究期望為降糖功能性成分研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為功能性食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的研究提供參考依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)芫花素的水溶性較差，所以想要充分開發(fā)利用芫花素，其生物利用度方面有待于進(jìn)一步探討。