蝴蝶蘭‘紅箭’組織培養快繁技術

陳 春

(福建省林業科技試驗中心，福建 南靖 363600)

蝴蝶蘭(Phalaenopsisspp.)屬于蘭科蝴蝶蘭屬，因其具有很高的觀賞價值與經濟價值，被稱為“蘭中皇后”，可作為盆栽和鮮切花銷售，深受消費者青睞[1-3]。蝴蝶蘭‘紅箭’是以‘瑞麗美人’為母本、‘臺林紅天使’為父本，通過人工雜交的方法選育出的新品系(良種編號：閩R-SC-DR-026-2015)。該品種是蝴蝶蘭大紅花系列，株型整齊，葉片挺立勻稱，花序排列對稱整齊，花型豐滿圓潤，花色鮮紅，色澤艷麗、均衡，花瓣邊緣略帶白邊，唇瓣深紅無雜色，柱頭花粉苞片雪白，平均花梗長達100 cm以上，最長可達110 cm，花梗粗壯，尤其適合作為鮮切花品種；具有花期長、耐低溫等優點，適合作為國內市場的年銷花，市場應用前景廣闊。

蝴蝶蘭組織培養已有較多的報道[4-15]，但不同的蝴蝶蘭品種，其培養條件差別也較大[4，15]，研究結果有較大的不同。而‘紅箭’組織培養技術未見報道。為此，本研究對蝴蝶蘭新品種‘紅箭’的誘導、增殖、生根培養及組培苗移栽等關鍵環節開展系統研究，以期建立其組織培養快繁技術體系，為蝴蝶蘭新品種‘紅箭’種苗規模化生產及推廣應用提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘紅箭’是漳州森暉蘭花產業有限公司和福建省林業科技試驗中心共同培育的蝴蝶蘭新品種。2019年3月從溫室大棚中選取花朵無畸形、無病蟲害的花梗作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒 用剪刀將花梗上的花朵剪掉，將外植體用稀釋過的洗衣粉溶液浸泡10 min，再用自來水沖洗30 min，放置于超凈工作臺上備用。具體消毒方法(表1)：將75 %酒精倒入外植體的燒杯中輕輕震蕩消毒30、45、60 s，之后用無菌水清洗外植體3～5遍；然后用0.1 % 升汞消毒，消毒時間設置為15、20、25、30 min，最后以無菌水震蕩沖洗5～6遍。將消毒后的外植體切成2 cm左右且帶芽點的小段，接種到誘導培養基中，每個消毒處理接30個外植體，3次重復。培養20 d后觀察、統計并計算污染率、死亡率、存活率。污染率/% = 污染外植體數/接種總外植體數×100；死亡率/%=死亡的外植體數/接種總外植體數×100；存活率/%=100-污染率-死亡率。

1.2.2 不定芽的誘導培養 不定芽誘導的基礎培養基為MS+蔗糖30 g·L-1，應用L9(34)正交試驗設計方法，6-BA質量濃度為：3.0、5.0、7.0 mg·L-1；Ad(腺嘌呤)質量濃度為：0、5.0、10.0 mg·L-1，NAA質量濃度為：0、0.3、0.6 mg·L-1，各處理因子水平見表2。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體，3次重復。30 d后，觀察并分析不定芽的萌發及生長狀況，進行正交試驗方差分析，篩選‘紅箭’的最佳誘導培養基。誘導率=萌發的外植體數/接入的總外植體數。

1.2.3 不定芽的增殖培養 增殖培養基礎培養基為MS+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，附加不同質量濃度的6-BA(分別為4.0、5.0、6.0、7.0 mg·L-1)和NAA(分別為0.2、0.4、0.6 mg·L-1)(表4)。每個處理接30個不定芽，3次重復。培養50 d后，分析不定芽的增殖系數并觀察其生長情況。增殖系數=總不定芽數/接種的不定芽數。

1.2.4 生根誘導培養 不定芽生長至2～3 cm且有3個葉片以上時，接種到生根壯苗培養基中。生根基礎培養基為1/2 MS+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+活性炭1.5 g·L-1+蔗糖20 g·L-1，附加不同質量濃度NAA(0.2、0.4、0.6 mg·L-1)和IBA(0.2、0.4、0.6 mg·L-1)，具體組合見表5。每種培養基接種30瓶，每瓶接種10個不定芽，3次重復。45 d時，統計平均根數、平均根長、平均生根率。平均生根率/%=培養45 d時的生根苗數/接種的芽數×100。

1.2.5 煉苗及移栽 ‘紅箭’的組培苗根長至3 cm以上且長出3片葉子時即可煉苗及出瓶移栽[7-8]。煉苗7 d后，可將組培苗移栽到不同的基質中進行栽培，基質分別為水苔、樹皮、水苔∶樹皮=2∶1、水苔∶樹皮=1∶1，共4個處理(表6)，每個處理移栽30株組培生根苗，3次重復。組培苗移栽后應澆透水，并注意保持一定濕度，放置在溫室大棚中栽培40 d時，統計成活率，并觀察植株的生長情況。

1.3 培養及栽培條件

組織培養時，培養基均添加瓊脂7.0 g·L-1，pH值均調至5.60～5.80，培養室溫度控制在22～25 ℃，光照強度為2500～3000 lx，光照的周期控制在10～12 h·d-1。煉苗及移栽時，白天溫度為25～28 ℃，夜間溫度為20～22 ℃。

2 結果與分析

2.1 消毒時間對‘紅箭’外植體無菌體系建立的影響

由表1可知，不同酒精和升汞的消毒時間對花梗污染率和死亡率的影響顯著。當酒精消毒時間少于60 s時，隨著酒精和升汞消毒時間的延長，污染率均呈下降趨勢；升汞消毒時間達30 min時，外植體開始出現死亡現象。處理12(酒精消毒時間為60 s和升汞消毒時間為30 min)的死亡率最高，達44.9%；處理11(酒精消毒60 s，升汞消毒25 min)的污染率最低，但有一部分外植體死亡，死亡率為28.0%，存活率50.4%；而處理7(酒精消毒45 s、升汞消毒25 min)的外植體污染率為23.5%，死亡率為0，存活率高達76.5%。因此本試驗篩選出‘紅箭’的最適消毒方法為處理7。

表1 消毒時間對花梗誘導的影響

2.2 植物生長調節劑對花梗誘導的影響

將消毒后的‘紅箭’花梗接種到不定芽萌發誘導的培養基上，15 d左右不定芽開始萌發。正交試驗結果(表2)表明，不同的植物生長調節劑組合，‘紅箭’梗誘導率不同，添加一定濃度的6-BA、Ad、NAA有利于‘紅箭’不定芽的誘導。9組處理中，處理5的平均誘導率最高，為84.6%。‘紅箭’梗誘導培養基的最佳組合為A2B2C3，也就是MS+6-BA 5.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。3個因子A(6-BA)、B(Ad)、C(NAA)對‘紅箭’的花梗誘導率的影響不同，其影響力為A>B>C，6-BA對‘紅箭’花梗不定芽的誘導影響最大，其次為Ad，最后是NAA。方差分析結果(表3)顯示，6-BA、Ad、NAA 3個因子對‘紅箭’的誘導率的影響均極顯著(P<0.01)。

2.3 不同濃度的6-BA與NAA組合對不定芽增殖的影響

從表4可以看出，當NAA質量濃度相同時，不同質量濃度6-BA的增殖系數差異顯著，隨6-BA質量濃度增加，增殖系數也隨著增大，6-BA質量濃度7.0 mg·L-1時，增殖系數達4.36，然而此時的不定芽葉色轉淺，葉片未展開，芽弱而小。綜合增殖系數及苗木的生長狀態，6-BA的質量濃度為6.0 mg·L-1較為適宜。當6-BA質量濃度為6.0 mg·L-1時，NAA質量濃度在0.2、0.4 mg·L-1時的增殖系數最高，且顯著優于其它處理；NAA 0.2 mg·L-1時不定芽增殖系數為3.51，葉色深綠，葉片適中，芽粗壯。

表2 花梗不定芽誘導培養正交試驗結果

表3 誘導培養正交試驗方差分析

表4 不同濃度的6-BA與NAA組合對不定芽增殖的影響

2.4 不同濃度的NAA、IBA對紅箭生根的影響

不定芽生根培養約25 d時，可看到綠色根點長出，50 d時統計平均根數、平均根長、平均生根率以及觀察生根苗的生長情況。從表5可以看出，NAA和IBA均可以促進根的生成，雖然生根率均達100%，但附加IBA時，平均根數和根長均顯著高于附加NAA的處理。IBA質量濃度為0.4 mg·L-1時，平均根數最多，達4.20條；平均根長最長，達3.88 cm。綜上，‘紅箭’生根培養基為1/2 MS+IBA 0.4 mg·L-1+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+活性炭1.5 g·L-1+蔗糖20 g·L-1。

表5 不同濃度的NAA、IBA對生根的影響

2.5 不同基質對組培苗移栽成活率的影響

移栽40 d后觀察并分析移栽成活率。由表6可知，基質對移栽成活率的影響呈顯著差異。以水苔為基質時，‘紅箭’組培苗移栽成活率最高，達95.2%；在水苔中添加一定比例的樹皮，組培苗移栽的成活率降低；隨著水苔比例降低，成活率呈下降趨勢。這可能是因為蝴蝶蘭的根是氣生根，疏松、透氣、保肥保水性好的基質適合其生長，而水苔基質柔軟性好，且保水性和肥力強，因此本試驗選擇水苔作為組培苗移栽的基質。

表6 不同基質對組培苗移栽成活率的影響

3 結論與討論

本試驗確定了蝴蝶蘭‘紅箭’花梗的最佳消毒處理為75%酒精消毒45 s后，0.1%升汞消毒25 min；最佳誘導培養基為MS+6-BA 5.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，誘導率達83.5%；最佳增殖培養基為MS+6-BA 7.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+蔗糖30 g·L-1，增殖系數達3.36；最佳生根誘導培養基為1/2 MS+NAA 0.5 mg·L-1+香蕉80 g·L-1+土豆80 g·L-1+活性炭 1.0 g·L-1+蔗糖15 g·L-1，生根率達100%；蝴蝶蘭組培苗在以水苔為基質中，移栽成活率可達95.2%。

蝴蝶蘭植物組織培養無菌體系建立的成功與否主要取決于污染率的控制[4]。本試驗通過選擇合適的外植體，采用優化酒精與升汞消毒的時間，降低外植體的污染率和死亡率，這與宋火元[16]的研究相一致。

本試驗應用正交試驗，對花梗不定芽誘導培養基進行較全面的優化，發現‘紅箭’梗誘導培養基的最佳培養基為MS+6-BA 5.0 mg·L-1+Ad 5.0 mg﹒L-1+NAA 0.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，這個結果與已建立的組培體系的其它蝴蝶蘭品種的的培養基不一致[8-12]，這也進一步說明了蝴蝶蘭不同品種的組織培養條件差別較大。