五味解毒藥酒皮膚過敏性試驗研究

覃聰慧，黃秋燕，邱 泉，梁 平，羅 威，林國彪，李耀華

（1.廣西壯族自治區梧州市中西醫結合醫院臨床藥學科，廣西 梧州 543002；2.廣西壯族自治區梧州市中醫醫院醫院辦公室，廣西 梧州 543002；3.廣西中醫藥大學藥學院藥理教研室，廣西 南寧 530001；4.廣西中醫藥大學藥學院中心實驗室，廣西 南寧 530001）

五味解毒藥酒是梧州市中西醫結合醫院的院內協定方劑，其是根據名醫余培南主任醫師祖傳秘方加減而得，由小葉三點金、半邊蓮、短冠東風菜、紅背絲綢、通城虎等五味民間常用治療毒蛇咬傷的瑤藥材組成，按一定比例經白酒浸泡一定時間制得的外用中藥制劑[1]。該藥酒具有清熱解毒、祛風除濕、活血散瘀、消腫止痛止癢等功效，外用治療毒蛇咬傷、毒蟲咬傷、蜂蟄傷等。該藥酒在我院臨床應用多年，在治療毒蛇咬傷中具有顯著的臨床療效。毒蛇咬傷中毒是由于蛇毒中的毒素引起病變。蛇毒成分復雜，毒蛇咬傷的危害性很大，輕者僅有瘙癢、麻木感或者劇痛，明顯腫脹，伴瘀斑、血皰或組織壞死、潰爛等，可出現發熱、煩躁不安、心律失常及各種出血等全身癥狀；重者可有循環衰竭或腎功能衰竭，或可出現呼吸肌麻痹而死亡，同時還會出現休克、心力衰竭、急性腎衰竭及彌散性血管內凝血等治療等嚴重并發癥。目前國內外治療毒蛇咬傷特效藥是抗蛇毒血清，治療毒蛇咬傷效果肯定，越短時間內注射抗蛇毒血清對機體越有益。但抗蛇毒血清一般的醫院不常規備藥，而且其貯藏條件為2 ℃～8 ℃，用藥前必須進行皮試，因此抗蛇毒血清在應用上受到了很大的限制。而五味解毒藥酒則可以彌補抗蛇毒血清難于保存、使用復雜的缺點，因此加快五味解毒藥酒的研發，將其制成質量穩定可控、療效確切、方便臨床應用的醫院制劑具有重要意義。本實驗主要觀察五味解毒藥酒外用對皮膚的致敏性，以期為臨床安全用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 五味解毒藥酒（生產批號14010901），由梧州中西醫結合醫院提供。米酒（賦形劑）（浙江國鏡藥業有限公司，度數50°）。2,4-二硝基氯苯（成都格雷西亞化學技術有限公司，生產批號201208071）臨用前用分析純的丙酮配制成1%的致敏濃度和0.1%的激發濃度。硫化鈉（成都市科龍化工試劑廠，生產批號2016062301）。

1.2 動物 白色成年豚鼠40 只（廣東江門市新會裕豐黑豚特種養殖場提供），體重250～300 g，雌雄各半。于廣西中醫藥大學動物實驗中心進行實驗，室溫（24±2）℃，濕度50%～70%，實驗期間雌雄單獨分開，實行分籠喂養，自由飲食，自由飲用清潔自來水。

1.3 方法 取豚鼠40 只，體重250～300 g，雌雄各半，預養3 d，分為4 組，每組10 只。于每只背部左側脫毛，面積3 cm×3 cm。分組為賦形劑組、藥酒組、陽性組以及空白組，分別將賦形劑、0.2 ml 五味解毒藥酒、1% 2,4-二硝基氯苯、NS 分別涂布于以上各組豚鼠的左側脫毛區，6 h 后清洗干凈，觀察給藥區皮膚的情況，并于24 h 觀察給藥涂布區皮膚紅斑、水腫和其他異常反應。重復3 次給藥致敏，在末次給受試物致敏后第14 天，將賦形劑、0.2 ml 五味解毒藥酒、0.1% 2,4-二硝基氯苯、NS 分別涂于豚鼠左側脫毛區進行激發，6 h 后清洗干凈，觀察給藥區皮膚情況，并于24、48、72 h 觀察脫毛區皮膚紅斑、水腫和其他異常反應。

1.4 觀察指標與評價標準 觀察并記錄豚鼠用藥前后體重、皮膚紅斑或水腫的情況。致敏反應發生率＝有皮膚紅腫或水腫（不論程度輕重）動物數/動物總數×100%。依照皮膚致敏性評價標準推斷受試物的致敏性[2，3]，見表1、表2。

表1 皮膚過敏反應程度的評分標準

表2 皮膚致敏性評價標準

1.5 統計學方法 采用SPSS 16.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以（）表示，采用t檢驗；以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 皮膚過敏性試驗對豚鼠體重的影響 試驗后4周，陽性組豚鼠體重低于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；賦形劑組、五味解毒藥酒組體重低于空白組，但差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組豚鼠體重比較（，g）

表3 各組豚鼠體重比較（，g）

2.2 皮膚過敏性試驗結果 陽性組0 h 時豚鼠皮膚出現中度紅斑，重度水腫，即皮膚隆起1 mm，輪廓清楚的情況，而且動物出現撓癢、舔給藥區情況，其中10只出現中度紅斑（10×2）分，9 只出現重度水腫為（9×3）分，1 只出現中度水腫為2 分，平均積分為（4.90±0.32）分；24 h 時發現皮膚水腫情況有輕微改善，其中10 只出現中度紅斑為（10×2）分，6 只出現重度紅斑為（6×3）分，3 只出現中度水腫（3×2）分，1 只出現輕度水腫為1 分，平均積分為（4.50±0.71）分；48 h時觀察皮膚為中度紅斑和輕度水腫的情況，其中10只出現中度紅斑為（10×2）分，1 只出現輕度水腫為1 分，平均積分為（2.10±0.32）分；72 h 時皮膚為輕度紅斑，水腫消失的情況，其中1 只出現中度紅斑為2分，9 只出現輕度紅斑為9 分，平均積分為（1.10±0.32）分，致敏率為100.00%。藥酒組、空白組和賦形劑組的動物皮膚未出現紅斑和水腫的情況，動物活動正常，未有異常反應，致敏率均為0。

3 討論

臨床前藥理毒理研究是藥物臨床前試驗的非常重要的組成部分，為臨床合理用藥及新藥注冊提供參考，其中一項中藥內容就是藥物過敏性、溶血性和刺激性試驗[4]。五味解毒藥酒為外用制劑，它通過透皮吸收而起到相應的藥理效應，在這個作用過程中，經過一定的潛伏期，也可能作為刺激物或者致敏物質對接觸的皮膚產生皮膚過敏反應性炎癥。過敏性試驗是通過動物重復接觸受試物后，觀察機體免疫系統在皮膚上的反應[3]，是應用受試物后產生免疫學傳遞的一種皮膚反應[5]。在動物首次接觸供試品一段時間后再次進行供試品的激發接觸，可觀察動物是否已出現過敏狀態，然后再通過激發接觸后的反應來判定受試動物有無發生過敏反應[6]。致敏反應常見于局部涂敷各種藥物，具有致敏性的藥物是廣泛的，新藥臨床研究前，應注意藥物的致敏性，應用于皮膚、粘膜等局部用藥、與已知具有致敏性的藥物結構或藥理作用類似者或在藥物合成生產中已表現出或可疑引起皮膚刺激、皮炎或接觸性皮炎等三種情況應優先考慮致敏試驗[7]。五味解毒藥酒是由小葉三點金、半邊蓮、短冠東風菜、紅背絲綢、通城虎等瑤藥材組成，其賦形劑為50°白酒，用藥途徑為患部皮膚涂擦，其化學成分復雜，目前尚未完全明確，賦形劑以及用藥途徑均符合優先考慮致敏試驗的情形。

本研究結果顯示，用藥進行3 次致敏后2 周，稱取豚鼠體重，陽性組豚鼠體重低于空白組，差異有統計學意義（P＜0.05）；賦形劑組、藥酒組體重低于空白組，但差異無統計學意義（P＞0.05），這可能跟陽性藥對豚鼠皮膚致敏較重有關，使豚鼠不適，從而明顯影響該組豚鼠的食欲。而藥酒組和賦形劑組的豚鼠體重變化值與空白組無差異，這表明五味解毒藥酒和賦形劑對豚鼠體重均沒有明顯影響。此外，整個實驗過程中藥酒組、空白組和賦形劑組的豚鼠皮膚整個實驗過程均未出現紅斑和水腫的情況，積分總和均為0，致敏率均為0。陽性組豚鼠的皮膚在試驗整個過程均有不同程度的紅斑和水腫出現，致敏率為100.00%，這表明五味解毒藥酒外用對豚鼠的皮膚無致敏性，提示五味解毒藥酒在動物試驗中過敏反應可能性小。由于毒蛇在野外生存身上不免帶有許多病菌，蛇傷患者咬傷部位常帶有細菌，極易引起皮膚軟組織感染，臨床救治中常會使用抗菌藥物進行抗感染治療。由于五味解毒藥酒是以高度白酒浸泡而得，與有些抗菌藥物容易產生雙硫侖樣反應，因此與其他藥物聯合使用時，尤其應警惕雙硫侖樣反應。此外，有三個方面的細節值得注意，第一是五味解毒藥酒是液體，在對豚鼠皮膚涂擦時，可能比較容易流失到其他部位，為了避免藥液的流失，應少量藥液分多次慢慢涂布，涂布后的豚鼠應單獨留置，待藥液全部吸收揮干后，在放回籠子；第二是本次皮膚過敏性試驗所使用的致敏劑是2,4-二硝基氯苯，這個致敏劑的配制較為特殊，應加以注意，在配制時，應保溫在50 ℃的熱水中進行，而且必須現配現用，溫度過高時溶液容易產生油珠，而溫度過低時幾乎不溶或者配制好的溶液由于溫度下降會析出結晶吸附在容量瓶底或者阻塞移液槍頭，影響實驗結果；第三，本實驗周期長，豚鼠之間存在個體差異，有些豚鼠脫毛區的毛發生長迅速，這對觀察豚鼠皮膚黏膜的變化產生一定的影響，因此，在實驗過程中應注意根據脫毛區毛發的生長情況進行一次甚至多次剃毛[8]。

綜上所述，五味解毒藥酒對豚鼠的皮膚無致敏性，是較安全的局部外用制劑。