反枝莧藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉享鋒 王武靜 楊燕妮 夏天乙 鐘仁興 彭明明 陳瑩 丁子禾 封帆 李書淵 王毅 舒尊鵬

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）14-1741-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.14.13

摘 要 目的：為反枝莧藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。方法：以7批反枝莧藥材為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行外觀性狀及粉末特征顯微觀察;采用薄層色譜法（TLC）對(duì)反枝莧藥材中蘆丁、纈氨酸、亮氨酸進(jìn)行定性鑒別，參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則相關(guān)方法測(cè)定其水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物含量。采用高效液相色譜法測(cè)定反枝莧藥材中蘆丁的含量，色譜柱為Agilent 5 TC-C18（2），流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液（40 ∶ 60，V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)為358 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：藥材外觀性狀及顯微結(jié)構(gòu)特征與現(xiàn)有描述相符。TLC鑒別結(jié)果顯示，7批藥材供試品色譜中，在與各對(duì)照品（蘆丁、纈氨酸、亮氨酸）色譜相應(yīng)的位置上均顯相同顏色的斑點(diǎn)。7批反枝莧藥材中水分的含量為7.43%～8.72%、總灰分的含量為11.82%～13.78%、酸不溶性灰分的含量為0.15%～0.55%、水溶性浸出物的含量為17.27%～24.74%。蘆丁檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為10～200 μg/mL（R 2=1.000 0）;精密度、穩(wěn)定性（24 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%（n=6）;低、中、高質(zhì)量濃度樣品中蘆丁的平均加樣回收率分別為99.14%、97.98%、98.80%，RSD分別為0.97%、0.95%、0.96%（n=3）。7批反枝莧藥材中蘆丁的含量為0.314～1.102 mg/g。結(jié)論：本研究對(duì)反枝莧藥材進(jìn)行了性狀觀察、顯微鑒別以及水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物含量等檢查項(xiàng)的考察，并建立了反枝莧藥材中亮氨酸、纈氨酸和蘆丁定性鑒別的TLC法以及蘆丁含量測(cè)定的HPLC法，可為反枝莧藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供一定參考。

關(guān)鍵詞 反枝莧;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);顯微觀察;水分;總灰分;水溶性浸出物;蘆丁;薄層色譜;含量測(cè)定

Study on Quality Standard for Amaranthus retroflexus

LIU Xiangfeng1，2，WANG Wujing1，YANG Yanni1，2，3，XIA Tianyi1，2，ZHONG Renxing1，2，PENG Mingming1，2， CHEN Ying1，2，DING Zihe1，2，F(xiàn)ENG Fan1，LI Shuyuan1，4，WANG Yi1，SHU Zunpeng1，2（1. School of Traditional Chinese Medicine， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 2. Guangdong Standardized Processing Engineering Technology Research Center of TCM Decoction Pieces， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Shenzhen Ausa Pharmaceutical Co.， Ltd.， Guangdong Shenzhen 518057， China; 4. Health Medical College of Guangzhou Huashang Vocational College， Guangzhou 511300， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To provide reference for the quality standard establishment of Amaranthus retroflexus. METHODS： Taking 7 batches of A. retroflexus medicinal materials as the research object， the appearance properties of the medicinal materials were investigated， and the microscopic characteristics of the medicinal powders were observed. TLC method was adopted to qualitatively identify rutin， valine and leucine in A. retroflexus medicinal materials. According to the relevant methods of the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅳ）， water content， total ash content， acid-insoluble ash content and water-soluble extract content were determined. HPLC method was used to determine the content of rutin in the medicinal material of A. retroflexus. The determination was performed on Agilent 5 TC-C18（2）column with mobile phase consisted of methanol-0.3% phosphoric acid solution （40 ∶ 60， V/V）， at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 358 nm， and the column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The appearance and microstructure characteristics of the medicinal materials were consistent with the existing description. The identification results of TLC method showed that 7 batches of medicinal materials and each reference substance （rutin， valine， leucine） showed spots of the same color at the same position. The moisture content of 7 batches of A. retroflexus medicinal materials was 7.43%-8.72%， the total ash content was 11.82%-13.78%， the acid-insoluble ash content was 0.15%-0.55%， and the water- soluble extract content was 17.27%-24.74%. The linear range of rutin was 10-200 μg/mL （R 2=1.000 0）. RSDs of precision test， stability test （24 h） and repeatability test were all less than 2.0% （n=6）. The average recovery rates of rutin were 99.14%， 97.98% and 98.80% in low， medium and high concentration of samples， and RSDs were 0.97%， 0.95%， 0.96%（n=3）. The contents of rutin in 7 batches of A. retrophylla were 0.314-1.102 mg/g. CONCLUSIONS： In this study， character observation， microscopic identification， moisture content， total ash content， acid- insoluble ash content and water-soluble extract content of A. retroflexus are investigated; TLC method was established for qualitative identification of leucine， valine and rutin in A. retroflexus， and the HPLC method was established for content determination of rutin. It provides reference for the quality standard establishment of A. retroflexus.

KEYWORDS? ?Amaranthus retroflexus; Quality standard; Microscopic observation; Moisture; Total ash; Water-soluble extract;Rutin; TLC; Content determination

反枝莧為莧科植物反枝莧Amaranthus retroflexus L.的干燥全草，于春、夏、秋季采收，主要分布于我國(guó)東北、華北以及沿長(zhǎng)江流域的各省份[1]。其味甘，性微寒，歸大腸、小腸經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、清肝火的作用，用于目赤腫痛、翳長(zhǎng)障和高血壓的治療[2]。反枝莧主要含黃酮、皂苷、生物堿以及甾醇類化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抑瘤生長(zhǎng)、降血脂、降低膽固醇等生物活性[3-4]。反枝莧是一種民間沿用歷史悠久的藥用植物，《神農(nóng)本草經(jīng)》《食療本草》《唐本草》《滇南本草》均對(duì)其有所記載[5]。因?qū)W名的不同，反枝莧也作為蒙藥“阿日白-淖高”被收載于《內(nèi)蒙古植物志》中，且已被廣泛使用于蒙醫(yī)臨床。然而，目前還未有反枝莧的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范，不足以指導(dǎo)該藥在臨床上的合理與規(guī)范使用?；诖?，本研究根據(jù)反枝莧的特點(diǎn)[6-8]，使用顯微鏡及薄層色譜法對(duì)其進(jìn)行鑒別，測(cè)定其水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物含量，并采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定反枝莧藥材中重要黃酮類成分蘆丁的含量，為反枝莧藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有LC-20AT型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、GL124-1SCN型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、SB25-12DT型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）、WFH-203B型三用紫外分析儀（上海馳唐電子有限公司）、DSZ2000X型倒置生物顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）、LDO-101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海龍躍儀器設(shè)備有限公司）、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、SHH.W21.420型智能恒溫水箱（北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

7批反枝莧藥材均由內(nèi)蒙古蒙醫(yī)藥工程技術(shù)研究院團(tuán)隊(duì)采摘并提供，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室王振月教授鑒定均為莧科植物反枝莧A. retroflexus L.的干燥全草。反枝莧藥材的來(lái)源信息見表1。蘆丁對(duì)照品（批號(hào)100080-201811，純度91.7%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;亮氨酸對(duì)照品（批號(hào)L-037-171216，純度>98%）、纈氨酸對(duì)照品（批號(hào)X-056-161216，純度>98%）均購(gòu)自成都生物科技有限公司;硅膠G購(gòu)自青島海洋化工有限公司;D101大孔吸附樹脂（20～60目）購(gòu)自江蘇東鴻化工有限公司;甲醇為色譜純，磷酸、乙醇、鹽酸等試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鑒別

2.1.1 性狀鑒別

本品根呈圓錐形，類白色或者淡黃色。莖長(zhǎng)20～80 cm，具有鈍棱、葉痕以及細(xì)毛。葉互生，有長(zhǎng)柄;葉片呈菱狀卵形或者橢圓狀卵形，葉長(zhǎng)5～12 cm，寬2～5 cm，先端漸尖，有小芒尖，基部楔形，全緣或波狀緣，葉柄長(zhǎng)1.5～3 cm，兩面及邊緣有柔毛。穗狀花序集成圓錐狀，苞片呈披針狀錐型，細(xì)尖頭，背面有突起，先端有白色針芒，花被片5，長(zhǎng)圓形或者倒披針形，透明膜狀，有一淡綠色中脈。種子扁圓形或近球形，黑色，直徑小于1 mm，有光澤。氣微，味淡。反枝莧藥材圖見圖1。

2.1.2 顯微鑒別

本品粉末呈黃綠色。顯微觀察可見纖維有厚壁和薄壁兩種，厚壁纖維紋孔不明顯，薄壁纖維紋孔明顯。導(dǎo)管主要由網(wǎng)紋導(dǎo)管（長(zhǎng)約0.1～0.3 mm）和螺紋導(dǎo)管（長(zhǎng)約0.18 mm）組成。非腺毛由多個(gè)細(xì)胞組成，頂端細(xì)胞呈圓形，長(zhǎng)約0.14 mm。種皮細(xì)胞呈多角形，紅棕色，大小約為200 μm×80 μm。葉表面氣孔為類圓形，不等式。草酸鈣簇晶眾多，大小不一，棱角稍鈍。反枝莧藥材粉末的顯微鑒別圖見圖2。

2.1.3 薄層色譜鑒別

（1）蘆丁薄層色譜鑒別。取本品粉末1 g，加50%甲醇25 mL，超聲（頻率40 kHz，功率600 W）處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干。殘?jiān)铀? mL使溶解后，上樣D101大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑1.5 cm、柱高10 cm），用水洗脫，當(dāng)洗脫至無(wú)色時(shí)換用15%乙醇200 mL洗脫，棄去洗脫液;繼續(xù)用30%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干;殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[9]。另取蘆丁對(duì)照品適量，加甲醇溶解并制成每1 mL含蘆丁1 mg的對(duì)照品溶液。按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0502薄層色譜法”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[11]。吸取上述供試品溶液3 μL、對(duì)照品溶液1 μL，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（6 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于紫外燈（波長(zhǎng)為365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。蘆丁鑒別的薄層色譜圖見圖3。

（2）氨基酸薄層色譜鑒別。取本品粉末1 g，加50%甲醇25 mL，超聲（頻率40 kHz，功率600 W）處理30 min，放冷，搖勻，濾過(guò)，濾液蒸干。殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取亮氨酸、纈氨酸對(duì)照品各適量，分別加甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0502薄層色譜法”進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[10]。吸取上述溶液各1 μL，分別點(diǎn)樣于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰乙酸-水-2%茚三酮乙醇溶液（3 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.25，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。氨基酸鑒別的薄層色譜圖見圖4。

2.2 檢查

2.2.1 水分含量測(cè)定

精密稱取7批反枝莧藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）各約2 g，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“0832水分測(cè)定法”的第二法——烘干法進(jìn)行測(cè)定[10]，每批樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果，7批樣品中水分的含量為7.43%～8.72%，平均含量為8.07%。反枝莧藥材中水分含量測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2.2 總灰分和酸不溶性灰分含量測(cè)定

精密稱取7批反枝莧藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）各約2 g，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2302灰分測(cè)定法”進(jìn)行測(cè)定[10]，每批樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果，7批樣品中總灰分含量為11.82%～13.78%，平均含量為12.76%;7批樣品中酸不溶性灰分的含量為0.15%～0.55%，平均含量為0.36%。反枝莧藥材中總灰分和酸不溶性灰分含量測(cè)定結(jié)果見表2。

2.2.3 水溶性浸出物含量測(cè)定

精密稱取7批反枝莧藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）各約3 g，按照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則“2201浸出物測(cè)定”項(xiàng)下的熱浸法進(jìn)行測(cè)定[10]，每批樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。結(jié)果，7批樣品中水溶性浸出物含量為17.27%～24.74%，平均含量為21.08%。反枝莧藥材中水溶性浸出物含量測(cè)定結(jié)果見表2。

2.3 蘆丁含量測(cè)定

2.3.1 供試品溶液的制備

取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲（頻率40 kHz，功率600 W）處理40 min，冷卻;再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

取蘆丁對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每1 mL含蘆丁0.2 mg的對(duì)照品溶液，即得。

2.3.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜注為Agilent 5 TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液（40 ∶ 60，V/V）;檢測(cè)波長(zhǎng)為358 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。分別取“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液、“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液以及空白溶液（甲醇），按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，待測(cè)成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度>1.5，理論板數(shù)按蘆丁計(jì)不低于3 000，且空白溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法的專屬性較好。系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的高效液相色譜圖見圖5。

2.3.4 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3.2”項(xiàng)下蘆丁對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到蘆丁的回歸方程為y=14 851x+270.36（R 2=1.000 0），表明蘆丁在質(zhì)量濃度10～200 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度考察

取“2.3.4”項(xiàng)下同一份蘆丁對(duì)照品溶液（100 μg/mL），按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁峰面積的RSD為0.12%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液（編號(hào)6），分別于室溫放置0、2、4、6、12、24 h時(shí)按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁峰面積的RSD為0.65%（n=6），表明該供試品溶液在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（編號(hào)1），按“2.3.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并采用外標(biāo)法計(jì)算其含量。結(jié)果，蘆丁的平均含量為0.887 mg/g，RSD為0.91%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)

取9份已知蘆丁含量的樣品粉末（編號(hào)3），每份約0.5 g，精密稱定，分別按樣品已知量的50%、100%、150%加入蘆丁對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行3份，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液中蘆丁的平均加樣回收率分別為99.14%、97.98%、98.80%，RSD分別為0.97%、0.95%、0.96%（n=3），表明本方法的準(zhǔn)確度較好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。

2.3.9 樣品含量測(cè)定

分別取7批樣品粉末（過(guò)三號(hào)篩）各約0.5 g，精密稱定，每批藥材平行稱定2份，分別按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中蘆丁含量，取平均值。結(jié)果，編號(hào)1～7的樣品中蘆丁的平均含量依次為0.886、1.102、0.707、0.342、0.837、0.923、0.314 mg/g。

3 討論

3.1 藥材鑒別與檢查

為了更好地鑒別藥材的基原，本課題組首先對(duì)7批反枝莧藥材的性狀和顯微特征進(jìn)行了鑒別。結(jié)果顯示，7批反枝莧藥材的性狀與《中國(guó)植物志（第二十五卷：第二分冊(cè)）》[9]及文獻(xiàn)[3]所描述的一致。在顯微鑒別中，可明顯地觀察到螺紋導(dǎo)管和網(wǎng)紋導(dǎo)管;也可觀察到紅棕色的種皮細(xì)胞，且隨處可見多細(xì)胞非腺毛以及鑲嵌于葉肉細(xì)胞的草酸鈣簇晶，與現(xiàn)有文獻(xiàn)記載的顯微鑒別特征相一致[3]。前人對(duì)反枝莧藥材有過(guò)單獨(dú)的顯微鑒別，但有關(guān)其水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物含量等檢查項(xiàng)并未見相關(guān)報(bào)道，故本研究考察了上述檢查項(xiàng)，結(jié)果測(cè)得7批樣品中水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物的平均含量分別為8.07%、12.76%、0.36%和21.08%。

3.2 定性和定量分析指標(biāo)成分的選擇

據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，反枝莧藥材中富含蛋白質(zhì)、維生素、脂肪酸等多種成分，且含有8種人體無(wú)法合成的必需氨基酸[2，11]。本課題組前期對(duì)反枝莧藥材中的氨基酸進(jìn)行了薄層色譜鑒別，發(fā)現(xiàn)亮氨酸、纈氨酸的斑點(diǎn)較為明顯，便于定性鑒別。同時(shí)，現(xiàn)有研究證實(shí)，亮氨酸和纈氨酸能夠協(xié)同發(fā)揮修復(fù)肌肉、控制血糖、供能等作用，是人體內(nèi)必不可少的氨基酸[12]。因此，本課題組最終選擇亮氨酸和纈氨酸作為薄層鑒別的指標(biāo)成分。而后，筆者通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，反枝莧中黃酮類成分含量較高[13]。蘆丁作為黃酮類成分的代表，具有抗炎、抗氧化、抗過(guò)敏、抗病毒等功效[14]。因此，本課題組選取蘆丁同時(shí)作為反枝莧藥材薄層色譜鑒別和HPLC含量測(cè)定的指標(biāo)成分。

3.3 薄層色譜條件的選擇

在蘆丁的薄層色譜鑒別研究中，前期筆者先以甲醇為溶劑進(jìn)行蘆丁提取，然后分別以乙酸乙酯-水-冰乙酸（5 ∶ 2 ∶ 1.5，V/V/V）和乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（9 ∶ 2 ∶ 1 ∶ 0.1，V/V/V/V）為展開劑展開，發(fā)現(xiàn)所得色譜圖均有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象。后經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)摸索后發(fā)現(xiàn)，這可能是樣品前處理方法不當(dāng)所致。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[9]后，筆者將上述所得的蘆丁甲醇提取液上樣D101大孔吸附樹脂柱，然后分別以水、15%乙醇200 mL、30%乙醇100 mL進(jìn)行梯度洗脫，以甲醇為溶劑對(duì)30%乙醇洗脫部位進(jìn)行蘆丁提取，再以乙酸乙酯-甲酸-水（6 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）為展開劑展開，所得色譜圖的斑點(diǎn)清晰、圓整，分離效果較好。在氨基酸的薄層色譜鑒別研究中，筆者參考文獻(xiàn)[15-16]，分別以正丁醇-冰乙酸-水（4 ∶ 1 ∶ 1，V/V/V）、0.2%茚三酮正丁醇溶液-冰乙酸-水（6 ∶ 2.2 ∶ 1，V/V/V）和正丁醇-冰乙酸-水-2%茚三酮乙醇溶液（3 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.25，V/V/V/V）為展開劑進(jìn)行展開。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以正丁醇-冰乙酸-水-2%茚三酮乙醇溶液（3 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 0.25，V/V/V/V）為展開劑時(shí)，所得色譜圖的斑點(diǎn)明顯且分離效果最好。并且，筆者后續(xù)通過(guò)考察其在不同廠家硅膠G板[青島海洋化工有限公司的硅膠G板、煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司的預(yù)制硅膠G板、實(shí)驗(yàn)室硅膠G自制板（硅膠G購(gòu)自青島海洋化工有限公司）]、不同濕度（32%、58%、72%）、不同溫度（4、25、35 ℃）下的展開效果，發(fā)現(xiàn)與本研究上述結(jié)果并無(wú)明顯差別，提示該方法的耐用性較好。

3.3HPLC測(cè)定條件的選擇

在HPLC測(cè)定過(guò)程中，筆者對(duì)供試品溶液的提取方法（超聲和回流提?。⑻崛∪軇状?、75%甲醇、50%甲醇、乙醇、75%乙醇、50%乙醇）及提取時(shí)間（30、40、50、60、90 min）等進(jìn)行了考察。結(jié)果，以甲醇為溶劑超聲提取40 min為制備供試品溶液的最優(yōu)提取方法。接著，筆者分別對(duì)不同流動(dòng)相[甲醇-0.1%磷酸溶液（45 ∶ 55，V/V）、甲醇-0.3%磷酸溶液（40 ∶ 60，V/V）、甲醇-0.3%磷酸溶液（65 ∶ 35，V/V）、甲醇-0.5%磷酸溶液（45 ∶ 55，V/V）、甲醇-0.5%磷酸溶液（55 ∶ 45，V/V）、甲醇-0.5%磷酸溶液（60 ∶ 40，V/V）]和不同柱溫（25、30 ℃）進(jìn)行了考察。結(jié)果，以流動(dòng)相為甲醇-0.3%磷酸溶液（40 ∶ 60，V/V）、柱溫為30 ℃時(shí)，可得到保留時(shí)間適宜、色譜峰分離度更佳的色譜圖，故最終選擇此條件作為檢測(cè)條件。而后，筆者通過(guò)觀察色譜圖及光譜圖發(fā)現(xiàn)，蘆丁在254、358 nm波長(zhǎng)處均有吸收，但當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為358 nm時(shí)，色譜圖的基線更平穩(wěn)、色譜峰分離度更好。因此，本研究最終選擇358 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。且方法學(xué)考察結(jié)果顯示，本文所建方法符合含量測(cè)定要求。

綜上所述，本研究對(duì)反枝莧進(jìn)行了性狀觀察、顯微鑒別以及水分、總灰分、酸不溶性灰分和水溶性浸出物含量等檢查項(xiàng)的考察，并建立了反枝莧中亮氨酸、纈氨酸和蘆丁的薄層色譜定性鑒別方法以及蘆丁的HPLC定量測(cè)定方法，可為反枝莧藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供一定的實(shí)驗(yàn)參考。然而，因本研究中所用的樣本批次、數(shù)量均較少，故暫未對(duì)各定量指標(biāo)的限度進(jìn)行初步擬定，后續(xù)仍需采用更多的不同產(chǎn)地的樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2021-01-28 修回日期：2021-06-16）

（編輯：林 靜）