真實世界中新型冠狀病毒抗體檢測結果的探究

戴菊華，林博之，孫新平

本文的創新點：

該研究針對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）早期，采用膠體金法進行新型冠狀病毒抗體檢測，臨床中確實有部分受檢者出現假陽性結果，提出嗜異性抗體這一較明確的干擾因素，對臨床有一定的價值。

本文的局限性：

（1）由于本中心不是COVID-19定點醫院，納入的COVID-19確診病例數僅1例，僅是單中心研究，多中心研究擴大樣本量會不會出現結果差異，尚需要進一步深入研究。（2）未被嗜異性抗體阻斷試管（HBT）封閉住的抗體陽性患者可能還存在其他潛在未明確的干擾因素，造成假陽性結果，需進一步研究。

國家衛生健康委員會發布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》診斷標準［1］提及新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）確診病例在原有核酸檢測和測序基礎上增加血清學檢測作為依據，并通過檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）特異性抗體來輔助診斷COVID-19。SARS-CoV-2抗體的檢測屬于血清學檢測的一種，包括膠體金法、化學發光法，抗體檢測對臨床實驗室的操作要求相對于核酸檢測要低，可以快速、大量檢測，且可以在二級以下的基層實驗室完成。因現狀是可用于SARS-CoV-2抗體檢測的試劑較少，而膠體金法操作便捷，只需15 min判讀結果，膠體金法被認為是在快速篩查SARS-CoV-2感染中有效的方法［2］。目前批準應用的抗體檢測試劑盒中，基于抗體的免疫學方法存在相當比例的假陽性情況，因此檢測試劑盒質量和檢測過程的質量控制均十分重要［3］。抗體檢測結果假陽性可能包括患者自身因素、試劑原因以及標本處理不當等原因。嗜異性抗體、類風濕因子、補體、自身抗體、血漿纖維蛋白等患者自身因素可能造成抗體檢測結果假陽性，也有可能因為試劑盒抗原的特異性或抗原提取的純度欠佳造成抗體檢測結果假陽性。故特異性免疫球蛋白M（IgM）/免疫球蛋白G（IgG）抗體必須進行兩次以上的動態檢測，才能夠成為COVID-19在病毒核酸檢測陰性情況下輔助的確診標準［4-5］。目前北京大學國際醫院大多采用核酸聯合膠體金法抗體檢測用于復工復產體檢及入院患者的篩查。在控制好試劑和標本因素的前提下，本文將對北京大學國際醫院SARS-CoV-2 IgM和/或IgG抗體結果陽性，但核酸檢測結果陰性患者的臨床資料進行總結，探究SARS-CoV-2抗體檢測結果假陽性的原因。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2020年3—6月北京大學國際醫院同時送檢SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體和核酸的8 678例受檢者的臨床資料進行回顧性分析，其中男3 968例、女4 710例。患者主要來自發熱門診、消化內科、急診科、產科、口腔科等科室。排除標準：只檢測SARS-CoV-2抗體或核酸其中一項者。本研究經北京大學國際醫院倫理審查委員會審核通過〔倫理批件號：2020-043（BMR）〕。

1.2 資料收集 收集受檢者臨床資料，包括流行病學史、臨床表現、實驗室檢查指標（SARS-CoV-2抗體和核酸檢測結果、類風濕因子、補體、免疫球蛋白）。

1.3 研究方法

1.3.1 試劑與儀器 SARS-CoV-2 IgM/IgG抗體檢測采用膠體金法，抗體檢測試劑購于珠海麗珠試劑股份有限公司和北京英諾特生物技術有限公司。麗珠試劑所測結果由GS1201膠體金試紙分析儀自動判讀，儀器采用單反射光原理并綜合光電技術，獲取試紙條表面反射的信號，判讀值≥0.230 0時判斷為陽性，＜0.230 0為陰性?？贵w陽性復核采用磁微?；瘜W發光法，儀器采用Wan200+全自動化學發光免疫分析儀（儀器和配套試劑均購于廈門萬泰凱瑞生物技術有限公司），樣本S/CO＜1.0時，SARS-CoV-2抗體檢測結果判定為陰性；S/CO≥1.0時，SARS-CoV-2抗體檢測結果判定為陽性。核酸提取試劑購于常州金麥格生物技術有限公司，SARS-CoV-2核酸檢測采用熒光逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術，試劑（PCR-熒光探針法）購于圣湘生物科技有限公司和北京卓誠惠生生物科技股份有限公司。PCR擴增采用羅氏Z480熒光PCR儀。嗜異性抗體阻斷試管（HBT）采用Scantibodies Laboratory Inc.，Heterophilic Blocking Tube，HBT-3IX762，批號：LSFF0041A。

1.3.2 標本采集 研究對象均采集空腹靜脈血5 ml，置于含分離膠的黃頭真空采血管內，充分混勻后靜置待血液凝固，2 500×g離心5 min。標本無溶血、被細菌污染、貯存時間過長、凝固不全等現象。采集研究對象咽拭子標本，采用一次性病毒采樣管，購于山東威高集團醫用高分子制品股份有限公司，型號：MHII型（含滅活劑，2個拭子），規格3.5 ml，進行SARS-CoV-2核酸檢測。

1.3.3 血清學檢測 樣本血清檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體按照試劑盒說明書進行，麗珠和英諾特試劑二者檢測結果均為陽性則認為SARS-CoV-2抗體陽性，抗體陽性采用磁微粒化學發光法復核。

1.3.4 SARS-CoV-2核酸檢測 采用RT-PCR技術，針對SARS-CoV-2基因組中開放讀碼框1ab（open reading frame 1ab，ORF1ab）和核殼蛋白（nucleocapsid protein，N）基因進行檢測。咽拭子標本和陰性、陽性質控品的RNA抽提嚴格按照試劑說明書進行。核酸檢測結果Ct值判讀以廠家說明書建議為準，對圣湘生物科技有限公司和北京卓誠惠生生物科技股份有限公司兩個廠家的試劑盒檢測核酸結果不一致的可疑結果應送疾病預防控制中心進一步確認。

1.3.5 HBT使用方法 每個樣品用一個HBT，保持直立，輕彈底部，使管內試劑全部聚集到底部。取下瓶蓋，吸取500 μl受檢者樣品加入試管底部，每個樣本更換一次吸頭，避免交叉污染，蓋好蓋子，輕輕翻轉震蕩5次，使樣品與試劑充分混合（每管中含有足夠的試劑，能滅活500 μl樣品中的嗜異性抗體），室溫孵育1 h。檢測處理后樣本，得到無嗜異性抗體干擾結果。

1.4 統計學方法 采用Excel進行數據錄入和統計學描述，計數資料以相對數表示。

2 結果

2.1 SARS-CoV-2抗體和核酸結果 8 678例受檢者中，8 677例SARS-CoV-2核酸檢測陰性，其中膠體金檢測SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者25例（0.288%），SARSCoV-2 IgG抗體陽性者5例（0.058%），SARS-CoV-2 IgM和SARS-CoV-2 IgG抗體同時陽性者0例；使用化學發光法復核后，僅3例（0.035%）SARS-CoV-2 抗體陽性，其中1例為膠體金法SARS-CoV-2 IgM抗體陽性（濃度：2.14 COI），2 例為膠體金法 SARS-CoV-2 IgG抗體陽性（濃度分別是：159.47 COI和 352.10 COI），其余27例均為陰性（0.311%）。1例受檢者SARSCoV-2核酸檢測陽性，N基因Ct值為26.18，ORF1ab基因Ct值為26.77，同時抗體IgM和IgG均為陰性，詳見表1。

表1 SARS-CoV-2抗體（膠體金法）和核酸檢測結果分析Table 1 SARS-CoV-2 antibody （colloidal gold method） and nucleic acid detection result analysis

2.2 SARS-CoV-2抗體陽性（膠體金法）受檢者的臨床特征分析及動態監測 分析30例SARS-CoV-2抗體陽性受檢者的臨床表現和流行病學史，30例受檢者均無流行病學史，其中有4例來自發熱門診，分別是3例系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythemlatosus，SLE）患者和1例化膿性扁桃體炎患者。其余26例臨床上無發熱癥狀，無COVID-19影像學特征，無淋巴細胞數目減少，不屬于疑似病例。30例SARS-CoV-2抗體陽性者進行動態監測，其中有10例IgM 抗體陽性是住院患者，進行2次以上動態監測結果仍為陽性，其余20例是門急診患者，未進行動態監測。

2.3 SARS-CoV-2抗體陽性（膠體金法）受檢者的類風濕因子、補體、免疫球蛋白水平分析 分析30例SARS-CoV-2抗體陽性（膠體金法）受檢者的類風濕因子、補體、免疫球蛋白的數據，結果發現，患者的類風濕因子水平均在參考范圍內（＜10.1 U/ml）。除1例SLE患者疾病活動期補體C3降低外，其他29例受檢者補體 C3（0.9～1.8 g/L）、C4（0.1～0.4 g/L）水平均在參考范圍內。3例SLE患者的IgG抗體水平稍升高（分別為 17.74 g/L、20.03 g/L、21.36 g/L），其余患者的 IgG（7.0～16.0 g/L）和 IgM（0.4～2.3 g/L）均在參考范圍內。

2.4 HBT對SARS-CoV-2抗體陽性結果的影響 嗜異性抗體是一種內源性干擾抗體，可與其他種屬的免疫球蛋白結合，包括作為免疫分析試劑的異源抗體，產生的途徑包括動物細胞輔助治療、注射疫苗、免疫抑制藥物、輸血、自身免疫性疾病、感染等，在體內相對穩定存在，具備一定的濃度，通常無病理生理作用，但在免疫學方法檢測中是重要的干擾因素［6］，普通人群嗜異性抗體的發生率為0.17%～40.00%［7］。采用HBT對SARSCoV-2抗體陽性（膠體金法）的標本進行處理后，25例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性的標本中，除1例結果仍為陽性外（判讀值由0.302 1降為0.241 6），其余結果均轉為陰性（判讀值 ＜0.230 0），而 SARS-CoV-2 IgG抗體陽性的結果均依然為陽性（判讀值＞0.230 0）。其中臨床上進行2次以上動態監測的10例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性的標本經HBT處理后均為陰性。

3 討論

抗體檢測結果假陽性或核酸檢測結果假陰性存在，均是無法完全避免的，因此建議為滿足臨床診斷的特異度和靈敏度時，可以聯合運用抗體篩查和核酸檢測方法，實現SARS-CoV-2感染的快速篩查與鑒別［8-10］。實驗室SARS-CoV-2核酸和抗體的檢測結果是COVID-19臨床診斷的重要依據，但臨床依然需要根據流行病學史、臨床癥狀及實驗室檢測結果綜合判斷，不能僅靠單一實驗結果，尤其要考慮抗體假陽性的可能。

30例采用膠體金法檢測SARS-CoV-2抗體陽性的受檢者均無流行病學史，且同時SARS-CoV-2核酸檢測結果均為陰性，排除感染SARS-CoV-2或既往感染SARS-CoV-2的可能，因此本研究認為這30例抗體檢測結果為假陽性。嗜異性抗體干擾免疫學方法檢測的原理是在抗原不存在的情況下，嗜異性抗體可與試劑中抗體Fc或者F（ab）段的決定簇非特異性結合，橋接捕獲抗體和檢測抗體，從而干擾免疫反應，使得結合到固相的標記抗體濃度升高，造成假陽性結果［6，11-12］。本研究采用HBT對30例膠體金法檢測SARS-CoV-2抗體陽性的標本進行處理后重新再檢測，其中24例抗體轉為陰性?？赡苡幸恍悠肪哂泻芨邼舛鹊氖犬愋钥贵w干擾，在這種情況下，HBT可能無法完全阻斷嗜異性抗體干擾。應該設計不同濃度梯度的嗜異性抗體封閉劑，但本研究所用HBT說明書提示每管中含有足夠的試劑，能滅活500 μl樣品中的嗜異性抗體，因此未進行倍比稀釋。本研究著重分析了沒有被HBT封閉住的1例IgM陽性和5例IgG陽性的受檢者，沒有被HBT封閉住的1例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者是一名女性，77歲，合并患有高脂血癥、高血壓、腦梗死、動脈粥樣硬化等多種基礎疾病，因白內障待行人工晶狀體植入術就診，無發熱和/或呼吸道癥狀等COVID-19相關臨床表現，無COVID-19影像學特征，無淋巴細胞數目減少，既往未感染SARS-CoV-2，因此可以排除感染SARS-CoV-2。5例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性者中1例以發熱、咽痛起病，臨床診斷為化膿性扁桃體炎，抗生素治療后好轉，排除感染SARS-CoV-2或既往感染SARS-CoV-2可能，其余4例受檢者臨床上無發熱癥狀，無COVID-19影像學特征，無淋巴細胞數目減少。以上6例受檢者均無流行病學史，且做SARS-CoV-2抗體檢測的同時均采樣進行SARS-CoV-2核酸檢測，檢測結果均為陰性。因此，本研究考慮可被HBT封閉住的24例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性者結果為嗜異性抗體干擾導致的假陽性可能性大，而沒有被HBT封閉住的1例SARS-CoV-2 IgM抗體陽性患者及5例SARS-CoV-2 IgG抗體陽性患者可能還存在其他潛在未明確的干擾因素，造成假陽性結果，需要進一步研究。這為臨床醫生提供了對SARS-CoV-2抗體陽性結果分析解讀的經驗，建議臨床醫生一定要結合受檢者的流行病學調查、臨床表現、實驗室數據及影像學資料等綜合進行分析及診斷。同時應考慮到實驗室的各種指標是在COVID-19患者感染后的不同階段才能出現變化，還應知曉實驗結果會受到許多因素的干擾。

嗜異性抗體可以與試劑中的免疫球蛋白結合，干擾體外免疫檢測，與膠體金試劑相比，化學發光法試劑中含有消除干擾的抑制劑，使假陽性樣本的存在可能性減小。因COVID-19疫情早期，膠體金法檢測SARSCoV-2抗體首先獲國家藥品監督管理局批準用于臨床；化學發光法檢測SARS-CoV-2抗體是后續被批準用于臨床，且還需要配套的儀器。本研究SARS-CoV-2抗體陽性樣本采用不同廠家膠體金試劑進行復檢，并同時進行核酸檢測。本研究再將30例膠體金法檢測陽性標本采用化學發光法進行復檢后，結果提示只有3例抗體陽性，抗體假陽性率明顯減低，這提示膠體金法檢測新冠抗體受嗜異性抗體干擾大于化學發光法。

干擾免疫學方法檢測系統導致假陽性結果的內源性干擾物質較多，最常見于類風濕因子、補體、免疫球蛋白、自身抗體等，通過非特異結合干擾檢測過程?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第八版）》［13］提到體內存在干擾物質如類風濕因子、嗜異性抗體、補體、溶菌酶等，抗體檢測可能出現假陽性。本研究數據發現30例SARS-CoV-2抗體假陽性受檢者的類風濕因子、補體、免疫球蛋白水平基本均在參考范圍內。因此本研究推測類風濕因子、補體、免疫球蛋白不是引起SARS-CoV-2抗體檢測假陽性的首要原因。

由于存在可能導致SARS-CoV-2抗體檢測假陽性的情形，《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第八版）》［13］強調抗體檢測的前提條件是，臨床懷疑COVID-19且核酸檢測陰性的患者及病情處于恢復期且核酸檢測陰性的患者可通過抗體檢測進行診斷。國家藥品監督管理局批準的SARS-CoV-2抗體檢測試劑說明書中也指出抗體檢測僅用作對SARS-CoV-2核酸檢測陰性疑似病例的補充檢測指標或疑似病例診斷中與核酸檢測協同使用，不能作為COVID-19確診和排除的依據，不適用于一般人群的篩查。一般不單獨以血清學檢測作為診斷依據，需結合流行病學史、臨床表現和基礎疾病等情況進行綜合判斷。血清SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體聯合檢測是SARS-CoV-2核酸檢測假陰性的有效互補［14］?？贵w的產生有一定的時期，抗體檢測結果還可幫助識別COVID-19患者的感染階段［15］。我院確診1例非典型癥狀的輕型COVID-19患者，有高風險小區密切接觸史，臨床表現有鼻塞、流涕、咳嗽，有黃痰，無發熱。其出現癥狀1 d后采樣發現SARS-CoV-2核酸陽性，而同時查IgM和IgG抗體均為陰性?！缎滦凸跔畈《痉窝自\療方案（試行第八版）》［13］提到“SARS-CoV-2特異性IgM抗體、IgG抗體在發病1周內陽性率較低”，因此考慮該患者可能是處于早期感染，尚未產生抗體，而不是抗體檢測假陰性。后續動態監測該患者抗體，2周時IgM結果為弱陽性，IgG抗體陰性，1個月時檢測抗體均為陰性。

本研究通過探究SARS-CoV-2抗體檢測結果的干擾因素，發現嗜異性抗體可能是導致膠體金法檢測SARSCoV-2抗體IgM假陽性的主要原因，在臨床實踐中，特別是非COVID-19疫情流行區域，當遇到SARS-CoV-2抗體陽性的情況，除了可以動態監測抗體結果的變化及動態觀察患者的臨床情況，還可以采用HBT對SARSCoV-2抗體陽性的標本進行處理，從而減少SARSCoV-2抗體假陽性報告率。而SARS-CoV-2抗體IgG假陽性原因需要進一步研究。臨床在分析解讀SARSCoV-2抗體檢測陽性結果時，一定要考慮實驗的干擾因素，非疑似COVID-19患者或確診COVID-19患者不宜進行SARS-CoV-2抗體檢測指導臨床。

作者貢獻：戴菊華進行課題的構思與設計，文獻查詢，撰寫論文；林博之進行數據收集、整理；戴菊華、孫新平負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。