聚丙烯酰胺類油田添加劑生物毒性測試方法*

馬 躍， 宮 琦， 李術元， 賴曉晴

(1. 中國石油大學 理學院， 北京 102249； 2. 中國石油集團工程技術研究院有限公司 鉆井液所， 北京 102206)

自1954年聚丙烯酰胺在美國實現商業化生產以來，大量丙烯酰胺類聚合物改性產品應用于污水處理、石油開采和醫藥開發等領域，隨著聚丙烯酰胺在自然環境中的老化降解，其降解產物具有較高毒性，一定程度上污染了自然環境[1-3].而鉆井液中使用的包被劑、增粘劑、降濾失劑等基本都是丙烯酰胺類聚合物[4-5]，因此，丙烯酰胺類聚合物產品作為油田添加劑受到了質疑.Sickles等[6]研究表明，丙烯酰胺具有生殖毒性，降低蛋白質活性，影響細胞的有絲分裂和減數分裂，從而引起生殖損傷.也有研究[7-9]表明，油炸食品中的微量丙烯酰胺可致癌，且長期接觸丙烯酰胺類物質還會導致“肌無力”等癥狀的產生，這是因為丙烯酰胺的毒性損害了神經系統.聚丙烯酰胺類油田添加劑的“環保”排放成為亟待解決的問題，而生物毒性是表征其環保性能的重要指標之一.

自20世紀70年代以來，利用生物監測器對環境中的污染物進行風險評價成為環境科學技術領域的研究熱點[10-13].發光菌測試方法具有快速、靈敏、簡便、價廉等優點，因而被廣泛用于排放樣品的生物毒性測試中[14-16].近兩年，用于《水溶性油田化學劑環境保護技術評價方法》(SY6788-2010)中的明亮發光桿菌T3小種凍干粉價格暴漲，且供貨不穩定.本文以費氏弧菌替代國標菌種并將其作為測試對象，以發光強度和抑制率為考核指標，通過一系列實驗考察費氏弧菌的穩定性，研究不同濃度的參比毒物對菌種發光強度和抑制率的影響，進而評價聚丙烯酰胺類油田添加劑的生物毒性.本文測試方法簡單方便，所用原料價格低廉，有效解決了發光桿菌T3小種價格昂貴、供貨不穩定的問題.此外，與國標中的氯化汞相比，參比毒物ZnSO4·7H2O能夠顯著降低毒性，并有助于開展油田添加劑的生物毒性機理研究.

1 實 驗

1.1 實驗儀器

所用實驗儀器包括產自湖南碧霄環境科技有限公司的BX-ATA-P型生物毒性測試儀、產自Thermo公司的不同量程精密移液器、產自凌拓(北京)化工玻璃儀器有限公司的不同量程容量瓶、燒杯、塑料瓶等.

1.2 實驗材料

實驗材料包括產自湖南碧霄環境科技有限公司的發光菌試劑盒(費氏弧菌)以及產自國藥集團化學試劑有限公司的ZnSO4·7H2O(分析純)和NaCl(分析純).聚合物包被劑在鉆井過程中可以起到有效分散鉆屑的作用，聚合物降濾失劑則可以起到防止濾失過大的作用.本實驗所用的包被劑和降濾失劑均為聚丙烯酰胺類聚合物，由新疆瑪湖和黑龍江大慶油田某些原料配制而成.高粘甲基纖維素CMC-Hv與聚陰離子纖維素PAC-Hv均為天然產品，分別購自廊坊市新興化工有限公司和宜興市通達化學有限公司，聚合物XC為生物合成聚合物.

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗類別

1) 陰性質控實驗：相當于空白實驗，以2%NaCl溶液為測試樣品，理想狀態下其抑制率為0%.

2) 陽性質控實驗：標準品為陽極參比毒物(ZnSO4·7H2O)，理想條件下其抑制率為100%.

3) 樣品測定實驗：共對8種物質進行發光細菌毒性測定，每一個樣品需要一根試管(需按順序標號).

1.3.2 凍干菌復蘇液配置

吸取1 mL凍干菌復蘇液(冷NaCl溶液)，滴加到裝有凍干菌的小試管中搖勻(約1 min)，進行生物細菌凍干菌的復蘇，復蘇溫度穩定在2～4 ℃.靜置3～5 min后，在暗室內可以肉眼觀測到藍綠色熒光，再利用滲透壓調液配置出20 mL凍干菌復蘇液(稀釋菌液).

1.3.3 發光強度測試與抑制率計算

準備若干支透明測試管并按順序編號.首先向每一只空測試管中各加入0.5 mL稀釋菌液，平衡靜置3～5 min后，再測試其初始發光強度.在上述已經加入稀釋菌液的測試管中，繼續加入0.5 mL待測樣品，設置反應時間，按照加樣的順序依次測定各測試管的發光強度.利用發光強度計算凍干菌的抑制率，相應計算表達式為

IR=(P0-P1)/P1×100%

式中：P0為初始發光強度；P1為檢測發光強度.

2 結果與討論

2.1 費式弧菌發光穩定性測試

為了驗證費式弧菌具有穩定的發光能力，同時考慮到室溫不穩定會影響測量結果的準確性，因此，在恒溫20 ℃下測量費式弧菌在陰性質控實驗中的發光強度，實驗中每2.5 min取一個測試點，直到30 min后結束實驗，共進行三組實驗，所得結果如圖1所示.圖1中RLU為相對發光強度單位，其數值隨著測試設備的型號變化而改變.

圖1 不同暴露時間對費氏弧菌發光強度的影響Fig.1 Effect of different exposure time on luminous intensity of vibrio fischeri

由圖1可見，在30 min內隨著暴露時間的增加，費式弧菌的生物活性逐漸降低，但降低趨勢很平緩，仍然具有較好的生物活性.可見，在20 ℃下費式弧菌存活狀態較好，未過多受到溫度的干擾.圖1中三組凍干菌復蘇時的初始發光強度分別為14.4×105、12.9×105、11.6×105RLU，即均具有很好的初始發光強度，這證明了費式弧菌無論是在運輸途中還是在冰箱保存過程中，都不易失去生物活性，因而具有較好的穩定性.觀察圖1可以發現，在30 min測量時間內，費式弧菌的發光強度未出現明顯下降，表明費式弧菌在測量過程中自然死亡率不高，且所測數據處于生物體實驗誤差范圍內.

2.2 參比毒物濃度的影響

依據ISO 11348-3標準方法要求，選擇易溶、穩定、常見、價廉、對人和環境危害小的ZnSO4·7H2O為毒性參照物，考察了不同濃度ZnSO4·7H2O對費式弧菌發光強度的影響，結果如圖2所示.

圖2 不同濃度ZnSO4·7H2O對費氏弧菌發光強度的影響Fig.2 Effect of ZnSO4·7H2O at different concentrations on luminous intensity of vibrio fischeri

由圖2可見，不同暴露時間下不同濃度ZnSO4·7H2O對費氏弧菌發光強度具有較大影響.當ZnSO4·7H2O濃度達到5 mg/L時，費氏弧菌發光強度開始明顯下降；當ZnSO4·7H2O濃度達到15～20 mg/L時，發光強度顯著下降，表明毒性參照物ZnSO4·7H2O的濃度越大，其對費氏弧菌發光強度影響越大，也就是其抑制率越高.這是因為Zn2+濃度越大，對費氏弧菌產生細菌熒光素酶的影響越大，因而測得的發光強度越小.當Zn2+濃度超過4.55 mg/L、暴露時間達到30 min時，費氏弧菌抑制率達到了96.0%，幾乎接近于100%的致死濃度.

2.3 20 mg/L ZnSO4·7H2O的影響

ISO 11348-3標準中規定的ZnSO4·7H2O參考濃度為19.34 mg/L，因此，有必要研究發光菌在20 mg/L ZnSO4·7H2O中發光強度隨時間的變化規律.配置20 mg/L ZnSO4·7H2O作為參比毒物，研究該濃度ZnSO4·7H2O作用下費氏弧菌的發光強度和抑制率，結果如圖3所示.

圖3 ZnSO4·7H2O對費式弧菌發光強度和抑制率的影響Fig.3 Effect of ZnSO4·7H2O on luminous intensity and inhibition rate of vibrio fischeri

《水溶性油田化學劑環境保護技術評價方法》(SY6788-2010)標準要求：相同濃度毒性參照物的相對標準偏差需要控制在10%以內.由圖3可見，濃度為20 mg/L的ZnSO4·7H2O溶液的5 min發光抑制率為60%，15 min發光抑制率為91%，30 min發光抑制率為95%.由此可見，5 min和15 min發光抑制率測試結果差異較大，而15 min發光抑制率為生物活性趨于平緩的轉折點，表明利用ZnSO4·7H2O進行陽性質控實驗時，應該在測試過程中選擇15～30 min作為測試時間，從而縮小誤差.

2.4 油田添加劑生物毒性測試

在20 ℃下對油田添加劑的生物毒性進行測試，結果如表1所示.表1中的添加量均為現場實驗中在保證實驗效果的前提下所需的最小添加量.

表1 油田添加劑的生物毒性測試結果Tab.1 Test results of biological toxicity of oil field additives

由于受到合成與自然降解條件的影響，表1中實驗數據存在較小偏差.聚合物包被劑和降濾失劑均為聚丙烯酰胺類產品，皆由實驗室配置(具體成分涉密).理想狀態下樣品發光抑制率不受暴露時間的影響，且處于相同環境下的實驗樣品受到自然死亡的影響也相同.由表1可見，實際上油田添加劑生物毒性隨暴露時間的延長而增大.相同暴露時間內，樣品包被劑-2毒性最大，包被劑-3毒性最小，而樣品降濾失劑-1和降濾失劑-4均為劇毒，降濾失劑-3毒性最小.當暴露時間為15 min時，復蘇過程導致發光抑制率還不穩定，因而具有較大誤差.當暴露時間由15 min延長到45 min時，發光菌抑制率均有所提高，但提高幅度相對較小.當暴露時間由45 min延長到180 min時，發光菌抑制率顯著提高.由于費氏弧菌在室溫下存在自然死亡現象，因而難以進行長時間測定.根據不同濃度ZnSO4·7H2O對費式弧菌發光強度的影響結果可知，15～30 min暴露時間段內費氏弧菌發光強度曲線走勢趨于平穩，因而15～30 min為較合適的測定時間.觀察表1可以發現，聚合物包被劑毒性較小，這是因為包被劑為丙烯酸和丙烯酰胺聚合物，分子量通常高于100萬，在鉆井液中添加范圍為0.2%～0.5%，由于添加量較小，因而其對毒性影響相對較小.聚合物降濾失劑由丙烯酰胺、丙烯酸和2-甲基丙磺酸單體聚合組成且毒性較大，這是因為其在鉆井液中添加量較大，需要引入更多基團或其他成分達到抗溫、抗鹽的目的，因此，其在生物毒性評價過程中的整體發光抑制率偏高.聚合物降濾失劑-3是一種低毒型產品，其余三種產品均為重毒或劇毒產品，此類型聚合物降濾失劑應用于鉆采過程中會嚴重威脅土壤土質和地下水的清潔，過多使用會破壞生態平衡.CMC-Hv、PAC-Hv和XC皆為大分子纖維素或天然產品合成產物，毒性較弱，比較環保.綜上所述，費氏弧菌發光抑制率可用于油田添加劑生物毒性的評價，同時也可用于土壤和水質的快速檢測.

3 結 論

費式弧菌在測量過程中存活率高、穩定性好，本文采用費氏弧菌替代GB/T15441-1995中明亮發光菌T3小種測定油田添加劑的生物毒性，其測試結果在誤差允許范圍內，解決了明亮發光菌T3小種價格昂貴、市場供貨不穩定等問題.與國標中的氯化汞相比，該測試方法選取的參比毒物ZnSO4·7H2O更加環保，且ZnSO4·7H2O濃度越大，發光強度越低，抑制率越高.費式弧菌檢測方法可以有效檢測丙烯酰胺單體的毒性，不僅可以評價油田添加劑的環保性能，還可推廣應用于土壤和水質的快速檢測，因此，可替代國標中的明亮發光菌T3小種，快速、便捷地進行生產現場的生物毒性測試.