藏藥中有效成分與功能蛋白的相互作用與相互識別

冀旭 孫芳云 趙勤 張曉英 李巖松

【摘 要】 目的：以櫟癭酸為例，研究藏藥有效成分與功能蛋白的相互作用與識別過程。方法：利用熒光發射光譜、同步熒光、紫外光譜等方法進行研究。結果：結果顯示櫟癭酸引起了牛血清白蛋白BSA熒光靜態猝滅;獲得不同溫度下二者的結合常數、結合位點數及結合過程中熱力學參數;得知二者結合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的自發、放熱過程;二者之間發生非輻射能量轉移，結合部位位于BSA分子Site Ⅱ位點，平均結合距離為4.134 nm;在識別過程中，BSA結構及色氨酸所處微環境疏水性增加，色胺酸殘基流動性增強。結論：通過本方法可建立一套用于表征藏藥中有效成分與功能蛋白之間相互作用與識別過程的實驗方法。

【關鍵詞】 藏藥;有效成分;功能蛋白;秦艽;櫟癭酸

【中圖分類號】R917 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）12-0054-07

Abstract：Objective Taking Roburic acid as an example，the interaction and recognition process between effective constituents of Tibetan medicine and functional proteins were studied in this paper. Methods Fluorescence emission spectroscopy，synchronous fluorescence，ultraviolet spectroscopy and other methods were used in this study. Result The result showed that，firstly，the binding procedures between Roburic acid and BSA were static quenching process caused by the formation of non-fluorescigenic complex; secondly，both binding constants and binding site numbers of Roburic acid and BSA at different temperatures were determined; thirdly，ΔG，ΔH and ΔS during the binding process can be obtained and all of these parameters were negative，which indicated the binding procedure between Roburic acid and BSA was spontaneous，exothermic reaction taking hydrogen bond and van der waals force as main force; fourthly，“Forster non-radiative energy transfer” was taken place between Roburic acid and BSA，and Roburic acid bound to the Site Ⅱ of BSA while the binding distances was 4.134nm; fifthly，during the recognition procedure，with the increasing concentration of Roburic acid，the hydrophobicity of both BSA structure and the microenvironment of tryptophan in BSA increased，and the tryptophan residues were no longer restricted.Conclusion This study can be used to establish a set of experimental methods to characterize the interaction and recognition process between traditional Tibetan medicine effective constituents and functional protein.

Keywords：Tibetan Medicine; Effective Constituent; Functional Protein; Gentianae macrophyllae Radix; Roburic Acid

在生物學中，分子間相互作用與識別是形成高度專一性識別、反應及調控等過程的基礎，諸如底物與受體的結合識別、酶反應及抗體-抗原的結合識別等。而在藥學，尤其是民族藥的開發研究領域，分子間相互作用也是一個重要的研究內容，它在基于傳統藥物的新藥篩選開發、藥物藥效學及藥動學研究中均得到廣泛應用。藏藥在我國有著悠久的應用歷史、深厚的民眾基礎及豐富的藏民族文化內涵。近年來，藏藥以其獨特的功效受到越來越多研究者的關注，對其的現代化研究與應用也日益得到重視。而關于藏藥當中有效成分與離子通道、膜蛋白等藥物受體、功能蛋白的相互作用與識別研究還未見報道。

秦艽為龍膽科植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.，麻花秦艽Gentiana straminea Maxim.，粗莖秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.或小秦艽Gentiana dahurica Fisch.的干燥根[1]，屬于常用藏藥[2-4]，藏文名為吉解嘎保、吉解那保等[5]。該藥物為藏族人民的繁衍生息做出了重要的貢獻，如《四部醫典》中記載：“吉解嘎?？芍瘟瓱岷湍憻帷?《如意寶樹》中記載：“吉解嘎保可止血，炮制后外敷消腫、愈傷。吉解那?？上祝嗡闹P節紅腫，喉蛾，咽喉嘶啞”;《晶珠本草》中記載：“吉解那可用于消腫、喉蛾、干黃水”等[5]。櫟癭酸為一種五環三萜類化合物，是2015版《中國藥典》中規定秦艽藥材的藥材鑒別成分[1]，其藥理臨床作用如抗炎也常見報道[6]。

本研究以藏藥秦艽為代表，選用秦艽中有效成分櫟癭酸，利用光譜學方法研究了櫟癭酸與以運載蛋白牛血清白蛋白（BSA）為代表的功能蛋白之間的相互作用與識別過程，旨在進一步理解傳統藏藥有效成分的作用機制。并以此為例，建立一套可用于表征其它藏藥有效成分與功能蛋白如受體、離子通道等之間相互作用與識別的實驗方法，進而為傳統藏藥作用機制的現代化分析研究，以及基于傳統藏藥的藥物開發提供實驗依據及理論支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 PerkinElmer LS55熒光光譜儀及PTP-1 Peltier system控溫控件，Perkin Elmer Lambda 25紫外-可見分光光度儀器光度計，Millipore Milli-Q超純水系統。

1.2 主要試劑 櫟癭酸（中國食品藥品檢定研究院，98%），用二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich，≥99.9%）配置成濃度為4.0×10-2 mol/L的儲備溶液。BSA（Amresco，>98%）用0.01mol/L的PBS配置成1×10-6 mol/L的儲備溶液。華法林（中國食品藥品檢定研究院，98%），布洛芬（大連美侖生物技術有限公司，>98%），實驗用水為二次去離子水。

2 實驗方法

2.1 熒光猝滅實驗 移取1×10-6 mol/L的BSA溶液 2 mL置于石英比色皿中并分別于288K、298K和308K實驗溫度下測定樣品的熒光發射光譜。測定完成后，用微量注射器分別向其中注入不同體積的4.0×10-2 mol/L的櫟癭酸儲備液進行混合，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成后分別于相應溫度下反應至穩定后再次測定其熒光發射光譜。相關儀器參數如下：激發波長278 nm，激發狹縫和發射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度1200 nm/min，掃描范圍300～400 nm。

2.2 結合位點競爭實驗 移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，分別注入華法林/布洛芬儲備液，使對應藥品終濃度均分別為1×10-6 mol/L，在298 K溫度下進行相互作用30 min。反應完成后，用微量進樣器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲備液，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，混合完成至反應穩定后再次測定其熒光發射光譜。相關儀器參數如2.1。

2.3 同步熒光 于298K下移取1×10-6 mol/L的BSA 溶液2 mL置于石英比色皿中，測定樣品同步熒光光譜。測定完成后，用微量注射器分別向其中加入不同體積的櫟癭酸儲備液進行混合，使得櫟癭酸終濃度分別為5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、35×10-6 mol/L，反應穩定后于298 K溫度下分別測定其同步熒光光譜。相關儀器參數如下：當測定Δλ=60 nm的同步熒光光譜時，激發狹縫和發射狹縫寬度均為3 nm。當測定Δλ=15 nm的同步熒光光譜時，激發狹縫和發射狹縫寬度均為8 nm。掃描速度均為1200 nm/min，掃描范圍220～320 nm。

2.4 Rees紅邊激發熒光位移的測定 分別在激發波長為266、272、278、284、290和296 nm下，測定1×10-6 mol/L的BSA溶液在298 K溫度下的熒光發射光譜，之后在BSA溶液中分別加入不同體積的櫟癭酸儲備液，使得櫟癭酸終濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6 mol/L，并測定其在不同激發波長下對應熒光發射光譜。相關儀器參數如下：激發狹縫和發射狹縫寬度均為3 nm，掃描速度1200 nm/min，掃描范圍300～400 nm。

3 結果與討論

3.1 BSA與櫟癭酸結合過程的熒光發射光譜分析 圖1所示為BSA與櫟癭酸在298 K溫度下作用過程的熒光發射光譜，可以看出，伴隨著櫟癭酸濃度的上升，樣品體系發生了熒光猝滅現象，熒光強度由754.3下降至487.9，同時最大熒光發射峰位從341 nm輕微的藍移至335.5 nm。這一現象表明BSA與櫟癭酸之間發生了相互作用，熒光發射峰位輕微藍移表明蛋白結構發生了細微的改變，蛋白結構的疏水性有了輕微的增加[7]。

3.7 BSA與櫟癭酸識別過程的構象變化-同步熒光光譜光譜分析

圖5展示了BSA在與櫟癭酸結合過程中當Δλ=60nm和Δλ=15nm的同步熒光光譜。從圖中可以看出，伴隨著加入的櫟癭酸濃度的增加，BSA在Δλ=60nm和Δλ=15nm時的同步熒光強度均發生了明顯改變，說明BSA分子中的酪氨酸、色氨酸殘基均參與了熒光猝滅過程，其中對色氨酸的猝滅效果更為明顯。同時我們注意到，伴隨著櫟癭酸濃度的增加，Δλ=15 nm時的同步熒光光譜的最大發射峰位并未發生明顯的改變，而當Δλ=60 nm的同步熒光光譜則顯示出輕微藍移現象，說明在BSA與櫟癭酸的結合過程中，蛋白中酪氨酸殘基所處的微環境微環境沒有明顯的改變，而色氨酸殘基所處的微環境微環境疏水性略微增強。

3.8 BSA與櫟癭酸識別過程的構象變化—紅邊激發位移（REES）分析 紅邊激發位移是指當溶劑介質存在緩慢舒張作用時，色氨酸中吲哚環與臨近偶極子的電子結合作用即可引起色氨酸電子躍遷能分配的一種現象，是一種監測熒光發色基團微環境改變的方法。當蛋白質受到激發光照射時，若蛋白質中色氨酸殘基所處微環境是流動的，則其在發射熒光之前就已經出現了緩慢舒張作用，此時色氨酸殘基產生的熒光光譜的發射波長不發生變化。如果色氨酸殘基處在受限環境當中，色氨酸中處于激發態的吲哚環將會產生緩慢舒張作用，并且激發波長不同，其發射波長也不同[18-19]。

在實驗中可以發現，在266 nm的激發波長下，BSA熒光發射光譜的最大發射波長位于346 nm，所以選取326（FL）和366（FR）這兩個等波長點進行雙波長處理。由圖6可見，在相同激發波長下，BSA的FL/FR值伴隨著櫟癭酸濃度的增大而上升，說明伴隨著BSA與櫟癭酸反應的進行，熒光發射光譜發生藍移[18]，這也從另一方面驗證“3.1”中得到的結果，即說明BSA結構的疏水性伴隨著反應的進行而有所增加。

當櫟癭酸濃度分別為0×10-6、5×10-6、15×10-6 mol/L時，隨著激發波長的逐漸增大，BSA的FL/FR值緩慢降低，產生了Rees現象，說明在上述情況下，BSA中色氨酸殘基的運動受到限制。然而，隨著體系中櫟癭酸濃度的擴大，當櫟癭酸濃度分別為20×10-6、25×10-6mol/L時，BSA的FL/FR值不再隨著激發波長的增大而明顯降低，即不再產生Rees現象，說明伴隨著櫟癭酸濃度的升高，由于BSA構象的改變，分子中色氨酸殘基處于了相對流動的微環境當中。

4 結論

本研究設計一種全面表征傳統藏藥中有效成分與功能蛋白相互作用與識別過程的實驗方法。本研究以藏藥秦艽中有效成分櫟癭酸以及運載蛋白為例，在不同溫度下利用本方法進行了實驗，結果顯示：櫟癭酸與BSA二者之間發生的結合作用引起了BSA內源熒光猝滅，造成的猝滅現象為形成了不發熒光絡合物的靜態猝滅過程。通過測量可獲得二者在不同溫度下結合常數、結合位點數以及結合過程中相關熱力學參數，并得知二者相互結合是以氫鍵和范德華力為主要作用力的自發、放熱反應過程。同時，二者結合過程中發生了非輻射能量轉移，且櫟癭酸結合于BSA分子中的Site Ⅱ位點，平均結合距離為4.134 nm。另外，在二者識別過程中，BSA結構的疏水性有輕微的增加，而且伴隨著櫟癭酸濃度的增加，BSA中色氨酸所處微環境疏水性有了輕微增加，微環境流動性逐步增強。

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（收稿日期：2021-02-26 編輯：程鵬飛）