HPLC法同時測定不同采收期珠子參中5種皂苷類成分含量

2021-08-09 04:22:11李慧鄒晨鑫高靜顏永剛張崗宋小妹楊新杰

中國民族民間醫藥·下半月 2021年6期

李慧鄒晨鑫高靜顏永剛張崗宋小妹楊新杰

【摘要】目的：建立不同采收期珠子參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1以及去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa 5種化學成分的含量測定方法。方法：采用Thermo C18 （5μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱;以0.02%的磷酸水溶液和乙腈進行梯度洗脫;柱溫 30 ℃;流速1 mL·min-1;檢測波長 203 nm。結果：不同采收期中5種化學成分含量積累在7月份達到最高。結論：7月份可作為珠子參最佳采收期，用于珠子參的質量控制。

【關鍵詞】珠子參;高效液相色譜法;皂苷類成分;不同采收期

【中圖分類號】R282 ? 【文獻標志碼】 A ? ?【文章編號】1007-8517（2021）12-0042-05

Abstract：Objective To establish a method for the determination of ginsenoside Rg1，ginsenoside Ro，chikusetsusaponin IVa，zingibroside R1 and deglucose chikusetsusaponin Ⅳ a in Panacis Majoris Rhizoma at different harvesting stages. Methods A Thermo C18 （5 μm，4.6 mm×250 mm） chromatographic column with gradient elution using 0.02% phosphoric acid aqueous solution and acetonitrile at 30 ℃ at a flow rate of 1 mL·min-1 and detection wavelength of 203 nm.Results The accumulation of the five chemical components in the different harvesting periods was highest in July.Conclusion The month of July can be used as the best harvesting period for quality control of Panacis Majoris Rhizoma.

Keywords：Panacis Majoris Rhizoma; High Performance Liquid Chromatography; Active Ingredient;Harvesting Time

珠子參Panacis Majoris Rhizoma（PMR）為五加科人參屬珠子參Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng ex C.Chow的干燥根莖，又名扣子七、珠兒參，主產于陜西、四川、云南、甘肅、寧夏、西藏等地，味苦、甘，性微寒，有滋陰養肺、止血活絡、益氣強身等功效[1]。珠子參根莖是主要的藥用部位，主要包含皂苷、多糖、黃酮、微量元素等，目前已經從珠子參不同部位分離獲得多個單體皂苷，珠子參總皂苷具有一定的鎮痛抗炎[2]、增強免疫[3]、抗腫瘤[4-7]等活性。珠子參生長緩慢成藥周期長，多生長于蔭蔽的林下等地，目前野生珠子參已處于極度瀕危狀態，對珠子參的研究也多為化學成分、藥理活性等，而栽培、資源分布等較少，因此合理規劃其采收期是極其重要的。本實驗采用高效液相色譜法對5～7月不同采收期珠子參中5種化學成分含量變化，來確定珠子參最佳采收期。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀; GB204 型電子分析天平（北京賽多利斯）; KQ-200KED 超聲波清洗機（江蘇昆山）; GZX- 9140MBE電熱鼓風干燥箱（上海博迅）。

1.2 試藥供試材料來源于陜西太白山種植基地，由陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定為五加科植物珠子參Panax japonicus C.A.Meg var.major （Burk.） C.Y.Wu et Feng。人參皂苷Ro（批號 111903-201805）和人參皂苷Rg1（批號110703-201933）均購于中國食品藥品檢定研究院，姜狀三七皂苷Rg1（批號B50413），竹節參Ⅳa（批號B21676），去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa（批號B24067）均購于上海源葉公司。

1.人參皂苷Rg1;2.人參皂苷Ro;3.竹節參皂苷Ⅳa;4.姜狀三七皂苷R1;5.去葡萄糖竹節參Ⅳa

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備珠子參根莖烘干，稱重，粉碎，取0.1 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱重。超聲處理40 min（功率500 W，頻率40kHz），放至室溫，補足失量，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，待測。

2.2 混合對照品溶液制備精密稱取各對照品適量，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用適量色譜甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，分別制成含人參皂苷Rg1 0.04 mg·mL-1、人參皂苷Ro 0.2 mg·mL-1、竹節參皂苷Ⅳa 0.25 mg·mL-1、姜狀三七皂苷R1 0.1 mg·mL-1、去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa 0.1 mg·mL-1的對照品儲備液，0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.3 色譜條件色譜柱為Thermo C18 （5 μm，4.6 mm × 250 mm）色譜柱;流動相為乙腈（A）-0.02%磷酸水（B），梯度洗脫（0～10 min： 5%～40%A; 10～22 min： 40%～75%A，22～34 min： 75%～90%A），檢測波長203 nm，柱溫30℃，體積流量1.0 mL·min-1，進樣量為10 μL。

2.4 線性關系考察精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液1、5、10、 15、20 μL，按“2.3”項下色譜條件測定峰面積，以進樣量為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸，得回歸方程，見表1。

2.5 精密度實驗精密吸取混合對照品溶液 10 μL，重復進樣 5 次，測定峰面積，計算得人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七皂苷R1、去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.3%、2.1%、2.5%、2.4%、1.1%。

2.6 重復性實驗精密稱取同一批樣品（采收時間2019年6月1日）6份，按“2.1”項下方法制備，吸取10 μL 進樣，測定峰面積，計算得人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa的RSD分別為2.4%、1.2%、2.3%、1.5%、2.1%，符合要求。

2.7 穩定性實驗取供試品溶液（采收時間2019年6月1日），分別于配制后0、3、6、9、12、24 h 進樣10 μL，測定峰面積，計算得人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.2%、2.3%、2.1%、1.6%、1.5%。結果表明，供試品溶液在 24 h 內穩定性良好。

2.8 加樣回收實驗精密稱取同一批樣品（采收時間2019年6月1日）珠子參藥材0.1g，平行稱定6份。分別精密加入人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七苷R1、去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa對照品適量，按2.1項下方法制備成供試品溶液在上述色譜條件下測定，計算得到各成分平均加樣回收率為97.3～99.3%，RSD為1.8～2.5%，表明方法準確度較好，結果見表2。

2.9 不同采樣時間中5中化學成分的含量測定精密稱取不同批次樣品珠子參藥材粗粉0.1 g，每組重復6 次，按“2.1”項下方法制備供試品，按“2.3”項下條件進樣分析，測定峰面積，計算含量，結果見表 3。5種成分從5月份開始含量積累逐步增加，直至7月份達到最大，隨后開始下降，其中人參皂苷Ro與竹節參皂苷Ⅳa最為顯著。

3 討論

中藥材有效成分含量對其質量至關重要，直接影響藥材藥理活性[8]。靳維榮等[9]發現黃芩在9月份黃酮類含量最高，李雪營等[10]發現不同采收期對黔產鴨跖草若也有顯著影響，研究表明7、8月采收最為適宜。

珠子參作為秦巴山區特色藥材之一，具有多種化學成分，不同時期的珠子參成分含量相差甚遠。本實驗首次建立HPLC法同時測定珠子參中人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa、姜狀三七皂苷R1和去葡萄糖竹節參皂苷Ⅳa 5種皂苷類成分含量的方法，結果顯示，5種皂苷類成分含量在不同時期的含量都存在明顯差異，隨著不同時期的采收可以看出5種皂苷類成分含量有明顯差異，5種皂苷類成分含量都在逐步增高，其中人參皂苷Ro、竹節參皂苷Ⅳa含量始終最高，7月份采收含量顯著高于其它月份采收樣品，說明珠子參適合夏末秋初采收，李淵源等[11]研究亦證實了這一點，本實驗結果與《陜西中草藥》[12]、15版《中國藥典》[1]中記載的珠子參采收期為“夏秋采挖”“秋季采收”有共同相似之處，為進一步證明傳統采收時間的合理性提供了科學依據，但具體時間還需根據氣候條件等考慮。本實驗只選取了5～8月份，且5種成分在7個時間點含量差距較大，分析原因可能是珠子參地上部分正在萌發從而導致根莖中的代謝產物質量減小，此外除不同采收時間對含量有所影響，如土壤溫度、空氣溫度、濕度、光合有效輻射等生態因素的不同有效成分也會發生不同程度的變化[13-14]，氣候對珠子參有效成分積累有待進一步研究。

綜上所述，經方法學考察，本研究所建立的HPLC法線性關系、精密度、重復性和穩定性均良好，可用于同時測定不同采收期珠子參藥材中5種有效成分的含量。

參考文獻

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫藥科技出版社，2015：271-272.

[2]姜祎，考玉萍，宋小妹.珠子參葉總皂苷抗炎鎮痛作用的實驗研究[J].陜西中醫，2008，29（6）：732-733.

[3]段徑云，陳瑞明.珠子參對血液和造血功能的影響[J].西北藥學雜志，1996，11（2）：72-73.

[4]宋蓓，徐悅，李玉澤，等.“太白七藥”珠子參化學成分及抗腫瘤活性研究[J].中南藥學，2019，17（8）：1210-1214.

[5]王炳淑，梁榮珍，戢楠楠.珠子參多糖通過靶向let-7a/CDK6分子軸調控胃癌MKN45細胞的增殖與凋亡[J].中國腫瘤生物治療雜志，2020，27（2）：135-141.

[6]史鑫波，唐志書，雷莉妍，等.珠子參提取物抗氧化活性及其對乳腺癌細胞的抑制作用研究[J].中南藥學，2019，17（12）：2073-2076.

[7]楊慶曉，姚姝妍，宋彬，等.珠子參湯劑對腦膠質瘤U87細胞增殖、凋亡的影響及其機制研究[J].中國煤炭工業醫學雜志，2019，22（5）：523-527.

[8]王存琴，汪雷，陳穎，等.高效液相色譜法同時測定不同采收期枸骨葉中4種三萜類成分含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2020，31（9）：1092-1096.

[9]靳維榮，石俊英，張小偉.不同采收期黃芩中六種黃酮類成分的動態研究[J].山東中醫雜志，2008（4）：268-271.

[10]李雪營，梁黔生，林先燕，等.不同采收期黔產鴨跖草中異葒草素含量及生物產量的動態變化[J].亞太傳統醫藥，2020，16（9）：75-76.