廣東梅香魚生物胺含量分析研究

陶志華，劉偉锜，喬娜，謝姝穎，陳泳琪，曹楚珩，何妍慶，梁綺琦，鐘家本

(廣東工業大學 輕工化工學院，廣州 510006)

1 概述

梅香魚(又名酶香魚)是廣東等沿海高溫地區的一種鹽漬自然發酵魚制品，在廣東沿海地帶作為配菜佳肴，頗具盛名。梅香魚在鹽漬過程中通過內源酶的自溶和微生物的發酵作用，產生特殊的梅香氣味[1]。魚在發酵過程會伴隨大量微生物的存在，微生物代謝作用會使蛋白質分解產生大量游離氨基酸、多肽和有機酸等風味物質，賦予腌制魚特殊的風味。而氨基酸又可能會在微生物的進一步作用下產生有害的代謝產物，生物胺就是其中微生物代謝的有害代謝物質，是在適宜條件下，魚肉中大量游離氨基酸在微生物的氨基酸脫羧酶作用下產生的，攝取過量的胺類會引起食物中毒現象，尤其是組胺，攝入過量的組胺會引起頭疼、惡心、嘔吐、痙攣，嚴重的會危及生命，其次是酪胺，尸胺和腐胺會加重組胺中毒癥狀[2-6]。而且生物胺能與咸魚中常存化合物亞硝酸鈉生成亞硝基胺類化合物，引起癌變[7]，魚類生物胺嚴重影響人體健康，從而產生嚴重貿易壁壘。美國FDA設限進口水產品組胺不得超過 50 mg/L, 酪胺≤100 mg/L，總生物胺含量不得超過1000 mg/L；歐盟規定鯖科魚制品組胺含量不能超過100 mg/L[8]；我國制定的GB 2733-2005中對組胺限量的規定：鮐魚不能大于100 mg/100 g，其他魚類則不能大于30 mg/100 g[9]。鯖科魚因含有大量的游離氨基酸易引起生物胺的累積，而鯖科魚加工的梅香魚制品的生物胺相關調查分析研究知之甚少，梅香魚可作為佐餐配料，是直接加工食用的咸魚，為廣東沿海的熱銷魚制品，所以展開梅香魚生物胺含量的調查，為梅香魚的食品安全控制提供了非常重要的參考數據。

2 實驗材料與方法

2.1 材料

市售梅香魚20塊(梅香魚個體大，超市切塊封裝賣，市場切賣)。

2.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙酸銨、三氯乙酸：廣州華鑫科技有限公司；組胺、酪胺、尸胺、腐胺、精胺、亞精胺、苯乙胺標準品、乙腈、二甲氨基萘磺酰氯：Sigma公司。

2.3 儀器

攪拌器、離心機、恒溫干燥箱、真空抽濾器；高效液相色譜儀(HPLC) 日本島津公司。

2.4 試劑的配制

5%三氯乙酸溶液：稱得25 g三氯乙酸，用水溶解，然后用容量瓶定容并稀釋至500 mL。

乙酸銨溶液(0.1 mol/L)：稱取3.584 g乙酸銨，用水稀釋定容至500 mL，備用。

飽和碳酸氫鈉溶液：稱取15 g碳酸氫鈉，溶于100 mL水中，置于試劑瓶中備用。

鹽酸(1 mol/L)：量取8.6 mL濃鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

二甲氨基萘磺酰氯(10 mg/mL)：稱取1 g二甲氨基萘磺酰氯，溶于100 mL丙酮中，混勻置于棕色瓶中，避光保存。

氫氧化鈉溶液(1 mol/L)：精準稱得4 g氫氧化鈉，然后倒入100 mL水完全溶解，備用。

生物胺標準品(1000 mg/L)：分別配制組胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、酪胺、精胺、亞精胺的標準品，分別稱取0.01 g，依次倒入8個10 mL小燒杯內，加入濃度為0.1 mol/L的鹽酸溶液對這8種樣品進行溶解，以0.1 mol/L鹽酸為定容液體到需求的刻度，充分攪拌至均勻，配制成濃度為1000 mg/L的標準備用溶液，放入-20 ℃的冰箱中保存。

2.5 實驗方法

2.5.1 標準曲線的制備

將配制好的8種生物胺標準品分別用0.1 mol/L的鹽酸稀釋至10.0，15.0，25.0，50.0，100.0 mg/L不同濃度的標準溶液，然后取0.5 mL，加入50 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、1.5 mL飽和碳酸氫鈉溶液、1.0 mL二甲氨基萘磺酰氯衍生溶液，振蕩混合均勻，置于40 ℃培養箱中避光反應45 min，中間振蕩2次，取出，加入0.1 mL 25%氨水暗處靜置30 min，再置于60 ℃水浴15 min除去丙酮，冷卻至室溫后用乙腈定容至5 mL，振蕩混勻，再用0.22 μL有機膜過濾后上機待測，得到峰面積，將其作為縱坐標，而濃度作為橫坐標，獲取8種生物胺的標準樣品濃度的線性關系。

2.5.2 樣品生物胺的提取及衍生

精準稱得魚肉樣品約5.0 g，對其進行剪碎處理，然后放入100 mL錐形瓶中，倒入10 mL 5%的三氯乙酸溶液，充分振蕩提取1 h，使用3600 r/min的離心設備離心10 min，然后對上部的清液進行提取，重復進行2次，然后以5%三氯乙酸為定容液體到25 mL，最后借助0.45 μL的有機膜進行過濾處理。

樣品的衍生：精準量得樣品0.5 mL，各自倒入50 mL 2 mol/L氫氧化鈉溶液、1.5 mL處于飽和狀態的碳酸氫鈉溶液、1.0 mL二甲氨基萘磺酰氯衍生溶液，充分振蕩混合后，使其達到均勻，然后放到40 ℃的水浴鍋內在無光的照射下進行45 min的充分反應，期間要進行2次振蕩操作，完成后導出，倒入0.1 mL 25%氨水在無光亮的環境中放置30 min，之后移動到60 ℃水浴鍋內15 min，目的是清除丙酮，冷卻至室溫后，以乙腈為定容液到需求的5 mL，充分攪拌至均勻，借助0.22 μm的有機膜進行過濾處理，之后放入小容器瓶內，等待機器測試。

2.5.3 高效液相色譜條件

色譜柱為 C18柱(柱長15 mm，柱內徑4.6 mm，柱填料內徑5 μm)，紫外檢測波長為254 nm, 進樣量為10 μm，柱溫為40 ℃，流速為1.0 mL/min，流動相A為 0.1 mol/L乙酸銨，流動相B為純乙腈，兩流動相在洗脫前需進行抽濾，并采用超聲儀器去除氣泡。通過樣品峰面積比對標準樣品峰面積計算生物胺含量。

3 結果與分析

3.1 線性關系

標準品通過濃度變化得到的峰面積作為縱坐標，而濃度作為橫坐標，測定可得8種生物胺的線性關系方程，見表1。

表1 生物胺的線性關系分析結果Table 1 The results of linear analysis of biogenic amines

續 表

在這8種生物胺標準品中，它們的濃度介于10～100 mg/L之間，有極好的線性關聯，對應的關聯參數中，除精胺(0.9796 μL)、亞精胺(0.9434 μL)外，其余都在0.99 μL以上，能夠滿足本實驗生物胺的檢測需要。

3.2 梅香魚生物胺含量分析結果

由表2得到生物胺的檢出率為：色胺40.0%，苯乙胺95.0%，腐胺100%，尸胺100%，組胺95.0%，酪胺100%，亞精胺75.0%，精胺85.0%。

表2 市售腌制魚生物胺含量情況Table 2 The content of biogenic amines incured fish mg/kg

國家衛生部的標準GB 2733-2005中對組胺含量的規定為:鮐魚≤100 mg/100 g，其他魚類≤30 mg/100 g的限量標準，組胺超出限量的有17條，所占比例為85%，組胺含量最高可達到132.4 mg/100 g，超出規定限量3.4倍。

根據美國食品藥品監督管理局(FDA)對生物胺的限量標準：水產品中的限量為組胺≤50 mg/kg，酪胺≤100 mg/kg。此次調查中，20份樣品中19份樣品的組胺含量均超過限量，超出限量的樣品比例為95%，所有樣品中酪胺的含量均超出限量，超出限量的樣品比例為100%。

除組胺與酪胺外，苯乙胺、腐胺、尸胺的檢出率均在90.0%以上，亞精胺與精胺的檢出率也在70.0%以上，通過本次調查分析，表明售梅香魚的生物胺含量存在極大的安全隱患。

4 結論

通過本次調查結果分析得到：色胺檢出率為40.0%，苯乙胺為95.0%，腐胺為100%，尸胺為100%，組胺為95.0%，酪胺為100%，亞精胺為75.0%，精胺為85.0%。依照美國食品藥品監督管理局(FDA)針對生物胺的標準使用量的規定，其中組胺的最高檢出含量為132.4 mg/100 g，已經遠遠超出限定量，超出限定量所占比例為95%。苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺的檢出率均在90.0%以上，亞精胺與精胺的檢出率也在70.0%以上。除組胺與酪胺外，以上其他6種生物胺各國雖無限量規定，但尸胺和酪胺能夠抑制腸道中二胺氧化酶和組胺-N-甲基轉移酶的活性，降低組胺分解，加強了組胺的毒性作用[10]。腐胺、尸胺等則能夠與亞硝酸鹽反應生成亞硝胺等雜環類致癌物質，其含量也不可忽視。

綜上所述，部分市售腌制魚中生物胺含量嚴重超過限量標準，市售腌制魚仍然存在一定安全隱患，為了保證梅香魚的安全性，加工儲藏工藝還需要進一步改進。