川西彝族酸菜汁中抗氧化乳酸菌篩選及益生特性研究

許強, 袁樂梅, 唐雪梅, 邊名鴻*

(1.固態發酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 宜賓 644000)

隨著人們生活品質的提高及健康意識的逐漸提升，具有一定益生特性的微生物菌劑的開發及應用受到了廣泛關注。在人、畜體內，乳酸菌是重要的菌群，具有維持微生態平衡的作用，是影響宿主健康的主要益生菌之一[1]。在體外，乳酸菌有類似抗氧化劑的作用，在抗氧化酶的作用下，可以清除體內的超氧陰離子及過氧化氫等，有降低機體氧化損傷、延緩衰老及預防病變的作用，是一種新型的天然抗氧化劑，因此在食品、醫藥等行業中應用非常廣泛[2]。

乳酸菌廣泛存在于醪糟、酸奶、泡菜等傳統發酵食品中，其中有不少具有特殊生理功能的菌株[3]，李丹丹等[4]發現在西藏牦牛酥油中存在自由基清除能力較強的乳酸菌，王琪等[5]在酸粥發酵液中篩選得到一株抗氧化活性較強的乳酸菌，鑒定為短乳桿菌。川西彝族酸菜產自川西高海拔地區，是彝族的傳統美食，在高寒高海拔生態環境中網羅了較多功能性強的微生物[6]，乳酸菌是其發酵過程中重要的優勢微生物，其中大多數具有較強的體外抗氧化活性。將其中抗氧化活性較強的乳酸菌經分離篩選后應用到傳統發酵食品中，不僅可以得到具有抗氧化特性的食品，還可以改善發酵食品的風味，具有較好的研究價值和開發前景。

本研究以彝族酸菜汁中篩選的乳酸菌為出發菌株，對比分析其抗氧化能力及胃腸道耐受性能力，旨在篩選具有益生菌潛力的乳酸菌，為乳酸菌益生菌劑的合理開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

彝族酸菜汁中分離到的40株乳酸菌：實驗室保藏；大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)：四川輕化工大學公共實驗室保藏。

MRS液體培養基：北京陸橋技術股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、牛膽鹽、胃蛋白酶、胰酶、過氧化氫、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷、硫酸亞鐵、水楊酸等：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 試驗儀器

DM300生物顯微鏡 徠卡儀器有限公司；PHS-2C精密pH計 上海虹益儀器儀表有限公司；756紫外可見分光光度計 上海奧普勒儀器有限公司；5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Scientz-IID超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；2720 thermal cycler PCR儀 Applied Biosystems公司；JY04S-3C凝膠成像系統 君意東方電泳設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 具有抗氧化性菌株的篩選

取乳酸菌發酵液于離心機中離心10 min后，用pH為7的PBS緩沖液反復吹打菌體，離心，重復3次后將菌體重懸至9.0 log CFU/mL。將菌懸液用超聲波細胞粉碎機冰浴破碎10 min，離心2 min后保留上清液，備用。

1.3.1.1 還原能力的測定

參照Lin等[7]的操作方法測定乳酸菌的還原能力，記錄其OD700 nm值。

1.3.1.2 清除羥自由基能力的測定

參照柳青[8]的方法測定乳酸菌羥自由基清除能力，計算公式如下：

清除羥自由基能力/%=(Ai-Aj)/(A0-Aj)×100%。

式中：Ai為DPPH乙醇溶液(0.2 mmoL/L)在OD517 nm的吸光值；Aj為以1 mL蒸餾水代替樣品液的對照組；A0為用1 mL蒸餾水代替樣品且體系中不包含H2O2的空白組。

1.3.1.3 清除超氧陰離子自由基能力的測定

參照Wang等[9]的研究方法，測定乳酸菌清除超氧陰離子自由基能力，計算公式如下：

清除超氧陰離子自由基能力/%=(△Ai-△A0)×100/△A0。

式中：△Ai和△A0為加入樣品和去離子水之前和之后鄰苯三酚自氧化的速率。

1.3.1.4 對DPPH自由基清除能力的測定

參照Wang等的研究方法，測定乳酸菌對DPPH自由基的清除能力，計算公式如下：

DPPH自由基清除能力=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%。

式中：A0為以1 mL乙醇代替樣品液的對照組；Ai為DPPH乙醇溶液(0.2 mmol/L)在OD517 nm的吸光值；Aj為以1 mL乙醇代替DPPH乙醇溶液的空白組。

1.3.1.5 耐受過氧化氫的能力

將乳酸菌菌懸液接種至H2O2濃度分別為0，0.4，0.7，1.0 mmol/L的MRS液體培養基中37 ℃恒溫培養。每隔2 h取樣，在OD600 nm處測定吸光值，觀察各組培養物對不同濃度H2O2耐受能力的變化情況[10]。

1.3.2 乳酸菌通過人體胃腸道能力的檢測

1.3.2.1 耐酸性

參照Abolfazl等[11]的方法并稍作修改，將乳酸菌接種至pH 2和pH 3的MRS液體培養基中。乳酸菌在pH 2的條件下培養60 min，在pH 3的條件下培養180 min，用傾注法計算乳酸菌菌落數。

1.3.2.2 膽鹽耐受性

參考陳歡等[12]的方法并稍作修改，將乳酸菌接種至牛膽鹽含量為0%、0.3%、0.5%和1.0%的MRS液體培養基中。培養24 h后，使用傾注法計算乳酸菌菌落數，并計算乳酸菌的膽鹽耐受能力。

1.3.2.3 對人工胃液和腸液的耐受性

將菌懸液分別加入10 mL的人工胃液和人工腸液，37 ℃厭氧培養。在人工胃液培養3 h時取樣，人工腸液培養4 h時取樣，梯度稀釋后以傾注法計算乳酸菌存活的菌落數并計算乳酸菌存活率。

1.3.2 4 菌株16S rRNA分子生物學鑒定及系統發育樹構建

將功能性較好的菌送至擎科生物公司測定16S rRNA序列，用Nucleotide BLAST對比后用MEGA軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 具有體外抗氧化能力菌株的篩選

2.1.1 還原力和清除羥自由基清除能力

乳酸菌具有一定的還原能力，能避免細胞受到活性氧的傷害[13]。而羥自由基是最活躍的ROS，會導致DNA、蛋白質和多糖化合物等的損傷，羥基自由基清除能力是反映菌株抗氧化能力的重要參數之一[14]。

由表1可知，菌株無細胞提取液(CFE)和菌懸液(IC)的還原力大于100 μmol/L L-半胱氨酸鹽酸鹽當量的菌株有20株，其中E5菌株的CFE與IC的還原力最高，分別達到227.33 μmol/L和290.67 μmol/L。所選菌株中有15株菌的CFE和IC的羥自由基清除能力大于30%，其中菌株LBS8的CFE羥自由基能力高達50.77%； LBS3的IC羥自由基清除能力為41.08%。不同乳酸菌對羥自由基清除能力有較大差異，可能是由于不同乳酸菌分泌抗氧化物質的種類和含量不同[15]。

表1 乳酸菌的還原力和清除羥自由基能力Table 1 The reducing power and hydroxyl radical scavenging ability of lactic acid bacteria

2.1.2 菌株超氧陰離子及DPPH自由基清除能力

選擇2.1.1中具有較高還原能力(IC和CFE>100 μmol/L)和羥自由基清除能力(IC和CFE>30%)的15株乳酸菌，測定其超氧陰離子自由基清除能力。

由表2可知，所選的菌株中有12株菌的CFE和IC的超氧陰離子自由基清除能力大于70%，其中MRS12的CFE超氧陰離子自由基清除能力高達82.91%，MC6的IC超氧陰離子自由基清除能力高達81.94%。所選15株菌中CFE和IC的DPPH清除能力大于30%的菌株有10株，其中MC2的CFE的DPPH自由基清除能力高達36.52%，MRS5的IC的DPPH自由基清除能力能達到39.11%，與Zhang等[16]提出的高活性乳酸菌概念相符。大多數菌株的菌懸液清除能力高于無細胞提取液的能力，原因可能是菌體可以持續分泌胞外多糖，多糖具有一定的供氫能力，通過氫原子或電子轉移的方式與DPPH自由基發生中和，以達到清除的目的[17]。

表2 乳酸菌的超氧陰離子和DPPH自由基清除能力Table 2 The superoxide anion and DPPH radical scavenging ability of lactic acid bacteria

2.1.3 耐受過氧化氫能力的測定結果

耐受過氧化氫能力是衡量乳酸菌抗氧化能力的指標之一，過氧化氫與超氧陰離子對細胞有較強的毒害，有加速細胞的衰老過程甚至殺死細胞的作用[18]，因此乳酸菌應具備一定的過氧化氫耐受能力。選擇2.1.2中還原能力、羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除能力都較強的菌株MRS2、MRS5、MRS12、SL1、LBS8、LBS9、M2、MC2、MC6、E5進行過氧化氫耐受能力分析，見表3。

表3 乳酸菌耐受不同濃度過氧化氫能力Table 3 The resistant ability of lactic acid bacteria to different concentration of hydrogen peroxide

由表3可知，在不同H2O2濃度中培養24 h后，隨著H2O2濃度的增加，菌體濃度均呈下降趨勢，10株菌株中，MRS12、LBS9、M2在1 mmol/L H2O2的環境中生長受到較大影響；其余7株菌在0～1 mmol/L H2O2的環境中生長良好。原因可能是這8株菌分泌有機酸、細菌素或過氧化氫等抗氧化性物質能力較強，使得乳酸菌對過氧化氫的耐受性較強[19]。

2.2 乳酸菌通過胃腸通道存活能力的檢測

2.2.1 菌株耐受pH 2、pH 3的能力

人的胃液pH通常為3左右，若在pH 3的條件下培養2 h后活菌數依舊高于6 log CFU/mL，菌株即可正常發揮其功能作用。

由表4可知，選擇耐受過氧化氫能力較強的7株菌在pH 3條件下處理180 min后，菌數均高于6.5 log CFU/mL，說明菌株在pH 3的條件下存活良好。在pH 2的條件下，僅有菌株MC2和MRS2的生長受到了嚴重的影響，在培養到60 min時，其活菌數分別為2.78 log CFU/mL和2.54 log CFU/mL。菌株LBS8、MC6、MRS5、SL1的活菌數均大于6 log CFU/mL，說明這4株菌能耐受pH 2的生長環境。

表4 不同pH對乳酸菌生長的影響Table 4 The effect of pH values on the growth of lactic acid bacteria log CFU/mL

2.2.2 菌株的膽鹽耐受力

乳酸菌對膽鹽的耐受力越高，說明其在腸道中的存活能力越強。各組乳酸菌對不同濃度膽鹽耐受能力的變化見表5。

表5 不同膽鹽濃度下乳酸菌的耐受能力變化Table 5 The resistant ability of lactic acid bacteria under different concentration of bile salt

由表5可知，隨著膽鹽濃度的增加，乳酸菌的生長受到一定的抑制。在膽鹽濃度為0.1%的條件下，乳酸菌的膽鹽耐受力均大于58%；在0.3%膽鹽濃度下，菌株LBS8、MC6、MRS5和SL1的膽鹽耐受力高于50%；在0.5%膽鹽濃度下，大部分菌株的生長均受到了抑制，而菌株LBS8、MC6、MRS5和SL1仍能存活，可見其膽鹽耐受能力較強。

2.2.3 乳酸菌對人工胃液和腸液的耐受能力分析

人體胃蛋白酶在酸性環境中被激活，殺死進入胃中的細菌，因此乳酸菌能通過胃腸道是發揮其功能特性的前提條件[20]。

由表6可知，在人工胃液中處理3 h后，各株乳酸菌的菌數均呈下降趨勢。其中菌株MC2的生長受到明顯的抑制，存活率低于40%。其余6株菌在pH 3的人工胃液環境中均有一定的耐受能力，其中菌株MRS2和MC6對胃液的耐受能力較強，大于90%。經過人工腸液處理4 h，除菌株MC2、MRS2以外，其他菌株存的活率較好，SL1、LBS8和E5能達到60%以上。

表6 乳酸菌在人工胃液和腸液中活菌數測定結果Table 6 The determination results of viable lactic acid bacteria number in artificial gastric fluid and intestinal fluid

2.3 16S rRNA分子生物學鑒定及系統發育樹構建

綜合比較2.2中7株菌的功能特性，選擇各功能特性都較強的4株菌LBS8、MRS5、MC6、SL1進行了分子生物學鑒定，結果見圖1。

圖1 基于16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.1 The phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequence

由圖1可知，菌株LBS8與Lactobacillusplantarumstrain KM4(MN493118.1)聚類在一起，同源性為100%，菌株MRS5與Lactobacillusplantarumstrain GV418(MN686265.1)聚類在一起，同源性為99%，因此這兩株菌鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，MC6與Lactobacillusparaplantarumstrain LABD15(MK758083.1)的同源性為98%，因此被鑒定為副植物乳桿菌(Lactobacillusparaplantarum)，SL1 與Lactobacillusparacaseistrain 1601(MN795083.1)的同源性為100%，被鑒定為副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)。

3 結論

以川西彝族酸菜樣品中分離得到的40株疑似乳酸菌為出發菌株，分別對其無細胞提取物與菌懸液的還原力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力及H2O2耐受能力進行檢測，篩選得到7株抗氧化能力較強的菌株。其中，菌株LBS8、MC6、MRS5、SL1分別在pH 2、pH 3和0.3%、0.5%膽鹽環境中培養24 h后仍能存活，且經人工胃液和腸液處理后，存活率均大于50%，各功能特性都較好。經16S rRNA基因同源性分析，確定菌株LBS8、MRS5為植物乳桿菌，菌株MC6為副植物乳桿菌，菌株SL1為副干酪乳桿菌。本研究所篩選的益生性乳酸菌菌株為其應用于彝族酸菜或進一步開發新型營養健康食品，所篩選的乳酸菌菌株具有一定的益生特性，并有發酵彝族酸菜或進一步開發新型營養健康食品的潛質。