八角籽油成分和抗氧化性分析

劉慧勤，李秋庭*，湯星月，吳建文，范興，廖浩，張榮林，陸順忠

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004；2.廣西林業科學院，南寧 530002；3.廣西職業技術學院，南寧 530226；4.廣西-東盟食品安全檢驗檢測中心，南寧 530029)

八角茴香是一種長青樹八角的果實，主產于中國西南部及越南等地，具有獨特的化學成分和香氣，廣泛應用于食品調味、中藥材及香水化妝品等領域[1]。中國八角占世界的80%左右，而廣西八角占中國年產量的90%以上[2]。八角果實晾曬及干燥加工過程中，籽與殼自行脫落，八角籽中油脂含量較多，而揮發性成分占很小一部分，一般被丟棄或者當作料，造成了極大的資源浪費。八角籽占八角整果干重的20%，含油率達到30%～35%，超過很多常見油料作物，且脂肪酸組成與其他常見食用植物油類似，是良好的油脂來源[3]。八角籽油同時具有獨特的八角茴香氣味，因此開展八角籽主要成分及八角籽油脂的研究對全面開發八角資源具有重要意義。

目前，隨著對食用油的深入研究，研究者漸漸轉向食用油中脂肪伴隨物的研究。植物油中具有生理活性的微量伴隨物主要有生育酚、多酚類物質、植物甾醇、角鯊烯等，而加工方法對油脂的產率和成分具有較大的影響。冷榨方法提油具有無溶劑殘留、快速方便、充分保留油脂中熱敏性物質等優點，深受消費者喜愛。工業中溶劑浸提在植物油脂提取過程中應用最為廣泛。而目前關于八角籽的研究較少，且主要是對八角籽溶劑提取物的揮發性成分為主。本文主要以冷榨法和索氏抽取法來提取八角籽油，并對比其理化特性及脂肪伴隨物，為八角籽油脂的開發利用奠定了一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和試劑

八角籽：購于廣西南寧高峰香料市場；37種脂肪酸標準品：購于上海安譜試劑公司；GC衍生化試劑雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺+三甲基氯硅烷(BSTFA-TMCS)(99∶1) TCI化成工業發展有限公司；膽甾烷醇(純度>95%)、菜油甾醇(純度>98%)、豆甾醇(純度>95%)、δ-生育酚(純度>95%)、角鯊烯(純度>98%)：均購于美國Sigma公司。

1.2 實驗器材

液壓榨油機 德州樂陵市祥明機械廠；羅維鵬比色計、數字折光儀、8040氣相色譜-質譜分析儀、UV-2700紫外可見分光光度儀 日本島津公司；TGL-16離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；LT9/11/B180馬弗爐 德國Nabertherm公司；Waters 2695高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 八角籽成分分析

粗脂肪：參照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》；蛋白質：參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》；灰分：參照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》；水分：參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》。

1.3.2 八角籽油的制備

冷榨八角籽油(P-SAO)是將分離好的八角籽經粉碎后，利用小型液冷榨油機對其進行冷榨，過濾后于4 ℃保存。

索氏抽提油(SE-SAO)是將八角籽粉碎至30目，置于索氏抽提裝置，石油醚(60～90 ℃)于85 ℃下提取，回流7 h，回收溶劑后于4 ℃下保存。

1.3.3 八角籽油理化性質分析

酸價(AV)的測定參照 GB 5009.229-2016；過氧化值(PV)的測定參照GB 5009.227-2016；采用羅維鵬比色計測量油脂的顏色，采用數字折光儀在20 ℃下測量油脂折光率。

1.3.4 八角籽油脂肪酸組成

取0.050 g油樣品于10 mL離心管中，加入2 mL 0.5 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，65 ℃皂化30 min，冷卻至室溫(25 ℃)。加入3 mL三氟化硼溶液，70 ℃水浴5 min，冷卻至室溫(25 ℃)后加入2 mL正己烷振蕩3～4 min，提取脂肪酸甲酯，加入無水硫酸鈉除水，以10000 r/min離心5 min。取上層液過0.45 μm濾膜，進氣相色譜-質譜聯用儀分析。

氣相色譜條件：CD2560色譜柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)，進樣口溫度為250 ℃，柱流量2.28 mL/min，色譜柱初始溫度為50 ℃，保持1 min，以速率20 ℃/min升溫至160 ℃，再以3 ℃/min升溫至205 ℃，最后以10 ℃/min升溫至250 ℃，保持16 min。載氣為氦氣，分流比10∶1，進樣量1 μL。

MS條件：離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃，掃描間隔0.04 s，電壓0.2 kV。

1.4 脂肪伴隨物

1.4.1 總酚含量

精確稱取1.000 g八角籽油于離心管中，加入2 mL 60%甲醇溶液，于搖床中以160 r/min的速度搖勻45 min后，以4000 r/min離心20 min，取0.2 mL樣液于10 mL比色管中，加入1 mL福林酚溶液，混勻1 min后加入4%碳酸鈉溶液至刻度，于75 ℃水浴保溫20 min，冷卻至室溫(25 ℃)后用紫外可見分光光度儀于760 nm處測定吸光度，結果以沒食子酸當量(mg GAE/g)表示。

1.4.2 磷脂含量(鉬藍比色法)

稱取約10.000 g試樣于坩堝中，加0.500 g氧化鈣，在電爐上加熱碳化后，在550～600 ℃馬弗爐中灰化，加入熱鹽酸(1∶1，V/V)10 mL溶解灰分，并加熱微沸5 min。將溶解液過濾注入100 mL容量瓶中，冷卻至室溫(25 ℃)后，以32%(m/V)氫氧化鉀溶液中和至出現渾濁，緩慢滴加鹽酸使沉淀全部溶解后，再滴2滴，最后用水稀釋至刻度。吸取被測液2 mL注入25 mL比色管中，加入2.5%鉬酸銨溶液2 mL、亞硫酸鈉溶液(0.16 g/mL)1 mL、對苯二酚溶液(0.005 g/mL) 1 mL，然后加水稀釋至刻度，加塞、搖勻，靜置30 min后于650 nm處測量其吸光度。

1.4.3 甾醇及角鯊烯含量

稱取0.030 g八角籽油，添加1 mg/mL，50 μL膽甾烷醇為內標，再加入3 mL 2 mol/L KOH-乙醇溶液，于90 ℃下皂化50 min后用5 mL正己烷提取2次，氮氣吹干后添加100 μL BSTFA-TMCS 試劑在烘箱中進行硅烷化處理，最后采用氣相色譜-質譜聯用儀測定八角籽油中角鯊烯及甾醇含量。

氣相色譜條件：DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，進樣口溫度320 ℃；氦氣流速0.7 mL /min。色譜柱初溫為180 ℃，保持1 min，再以4 ℃/min升溫至300 ℃，保持25 min。

質譜條件：傳輸線溫度300 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，離子源溫度250 ℃，全掃描模式，質量掃描范圍50～650 m/z。

1.4.4 生育酚含量測定

稱取1.000 g油樣于25 mL棕色容量瓶中，加入0.1 g BHT，再加入10 mL流動相超聲溶解后定容至刻度，搖勻后過0.22 μm濾膜并進Waters 2695高效液相色譜儀分析，2475 FLR檢測器；色譜柱：酰胺基柱(1.7 μm×3.0 mm×150 mm)；流動相：正己烷+[叔丁基甲基醚-四氫呋喃-甲醇混合液(20+1+0.1，V/V)]=90+10；流速0.8 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；熒光檢測器波長：激發波長294 nm，發射波長328 nm。

1.5 自由基清除能力

1.5.1 極性物質的提取

稱取1.0 g油脂于離心管中，添加2 mL甲醇，用渦旋儀渦旋3 min，6500 r/min離心10 min，然后取上清液到棕色瓶中，重復3次以上方法，結果以Trolox(TE mg/100 g)當量表示。

1.5.2 DPPH

取100 μL甲醇提取液，以甲醇稀釋至2 mL，然后添加2 mL 0.1 mmol/L DPPH甲醇溶液，混合后暗反應2 h，在517 nm條件下測吸光度。

1.5.3 FRAP

工作液的制備參照FRAP-2-G自由基清除能力試劑盒，在37 min條件下水浴30 min，將八角籽油甲醇提取液和上述950 μL工作液分別加入到1 mL石英比色皿中，在室溫(25 ℃)下反應10 min，然后在該條件下測量吸光度。

1.5.4 ABTS

按照ABTS-2-G試劑盒說明書進行工作液制備，將25 mL含過硫酸鉀的磷酸鹽緩沖液與ABTS混合，混合搖勻20 min后取上清液，然后將50 μL極性提取物和950 μL工作液混合，反應10 min后，在734 nm條件下測量其吸光度。

1.6 數據統計

采用SPSS 24軟件對所有數據進行獨立樣本T檢驗和標準化，結果均以平均值±標準差表示，采用Origin 2019作圖。

2 結果與討論

2.1 八角籽成分分析

本研究中八角籽脂肪酸含量為35.500%，蛋白質含量為11.430%，灰分含量為2.454%，水分含量為8.973%。八角籽含油率高，蛋白質含量豐富，因此冷榨油后的餅粕可以考慮作為飼料的一種來源。陽小勇等[4]采用索氏提取法提取不同季節的云南八角籽油，結果表明不同季節的八角籽含油率差別較大，本文研究均采用秋季的大紅八角。

2.2 油樣理化分析

八角籽油理化指標測定結果見表1。

表1 SAO理化指標Table 1 The physicochemical indexes of star anise seed oil

結果表明，不同方法提取的八角籽油的理化指標差異較顯著，P-SAO和SE-SAO顏色有很大區別，SE-SAO呈棕黃色，P-SAO呈金黃色。油脂顏色的差異可能是油中葉綠素和類胡蘿卜素含量的不同而引起的[5]。提取方式對八角籽油的折射率影響不顯著。徐靜的研究中得到索氏抽提八角籽油的折光率為1.463，比本研究索氏和冷榨八角籽油的折光率小，不飽和雙鍵數量增加及溫度降低均會使折光率增加[6]。P-SAO與SE-SAO酸價和過氧化值差異顯著，主要原因是索氏提取過程溫度較高導致甘油三脂氧化產生較多游離脂肪酸。本研究中P-SAO過氧化值高于SE-SAO，猜測可能是冷榨過程溫度較低，不足以使脂氧合酶完全失去活性，導致P-SAO過濾時因暴露在空氣中從而合成許多過氧化物。

2.3 脂肪酸分析

八角籽油中脂肪酸組分見表2，本研究中兩種方式提取油脂中總不飽和脂肪酸含量都達到了80%左右，P-SAO與SE-SAO均以亞油酸、油酸為主要脂肪酸，含量均達到40%左右，亞油酸和油酸在環氧合酶和脂氧合酶存在下可轉化為具有局部免疫調節作用但不同于激素的類花生酸。同時油酸和亞油酸也可使味覺感受細胞去極化，從而增加味覺感受的作用[7]。P-SAO和SE-SAO也都含有γ-亞麻酸，含量僅次于硬脂酸，γ-亞麻酸的代謝產物可以通過調節基因產物水平，影響免疫功能和細胞凋亡的基因表達，起到抗腫瘤和抗炎癥作用[8]。八角籽油具有高度不飽和性，因此可以添加到其他食用油中，以調和脂肪酸比例，從而更滿足脂肪酸的合理性。

2.4 總酚含量

總酚含量測定結果見表2，提取方式對八角籽油總酚含量影響較顯著。SE-SAO總酚含量高于常見冷榨食用油如大豆油(1.480 mg GAE/100 g)、菜籽油(1.31 mg GAE/100 g)、玉米油(1.26 mg GAE/100 g)[9]，接近堅果油(0.57～2.36 mg GAE/100 g)[10]。酚類作為一種抗氧化活性物質，受到研究學者的廣泛關注，在Chen等[11]的研究中，將3種酚酸與4-氨基二苯胺分子結合形成一種生物基多功能添加劑(BMAS)，添加BMAS到不同的植物油中，其抗氧化作用高于商業苯酚和芳胺。八角籽油總酚含量較高，是植物酚類物質的一個良好來源，具有較大的開發潛力。

表2 SAO脂肪酸含量Table 2 The content of fatty acids in star anise seed oil

2.5 磷脂含量

P-SAO和SE-SAO中磷脂含量見表3，兩種方式提取的八角籽油中磷脂含量差異較顯著。Judde[12]的研究中發現磷脂具有抑制p-茴香胺值和過氧化值的作用，使油脂氧化速度減慢。但是也有研究發現腦磷脂和糖發生反應生成一種“新的偽美拉德反應”而加深油脂的顏色，從而使油脂回色[13]。八角籽油中磷脂含量與蓖麻籽、花生油較為接近(0.200～10.000 mg/g)，高于芝麻油(1.000 mg/g)，低于大豆油(11.000～32.000 mg/g)。

表3 SAO的脂溶性成分含量Table 3 The content of fat soluble components in star anise seed oil

2.6 甾醇和角鯊烯含量分析

甾醇和角鯊烯是植物油中非常重要的脂肪伴隨物。P-SAO和SE-SAO甾醇及角鯊烯含量有明顯區別，見表2。兩種油中檢測到菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇，SE-SAO總甾醇含量高于P-SAO，兩種油樣甾醇的分配比基本相同，見圖1。β-谷甾醇在兩種油中含量最高，且含量超過總甾醇含量的60%以上，菜油甾醇含量約占30%。植物甾醇具有抑制膽固醇吸收、降低血清中低密度脂蛋白、預防冠心病等作用，是植物油中最主要的不皂物。目前暫無關于八角籽油中甾醇及角鯊烯的報道，與其他常見植物油相比，八角籽油總甾醇小于玉米油(5271.61 mg/kg)、菜籽油(5014.88 mg/kg)，高于橄欖油(489.33 mg/kg)、茶籽油(169.50～535.99 mg/kg)、大豆油(226.13 mg/kg)和花生油(1033.29～2153.19 mg/kg)[14]。角鯊烯是動物體內各種激素和植物固醇的前體，對肺癌、結腸癌和腫瘤具有預防作用。不同的提取方式對八角籽油中角鯊烯含量影響較大，其原因需要進一步探究。與常見植物油相比，P-SAO角鯊烯含量和棉籽(80 mg/kg)及茶油(120 mg/kg)接近，SE-SAO接近于菜籽油(260 mg/kg)和花生油(270 mg/kg)[15]。

P-SAO

SE-SAO

2.7 生育酚含量分析

八角籽油中生育酚含量見表3，P-SAO和SE-SAO中都只檢測到了δ-生育酚。兩種提取方式對八角籽油中生育酚含量影響較顯著。生育酚主要存在于富含脂肪細胞的周圍，如線粒體膜、油體和低密度脂蛋白膽固醇中[16]。一般植物油中生育酚存在形式為α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚3種形式，含量最多的一般為γ-生育酚。目前僅含有δ-生育酚的植物油脂鮮有報道，這應該是八角籽油所特有的。δ-生育酚通過提供氫原子與脂質氫過氧自由基結合，抑制脂質鏈式氧化，從而可有效阻止油脂儲存過程中的氧化反應[17]。目前食品中合成抗氧化劑BHT、BHA、PG等的安全性受到質疑，具有強抗氧化作用的生育酚得到了更多人的關注。

2.8 抗氧化能力

油脂在高溫度和含氧環境中容易氧化，引起油脂的氧化酸敗，其色、香發生變化，從而影響食品加工和貯藏過程中的品質，因此研究油脂的抗氧化作用具有重要的意義。本文采用3種方法(DPPH、FRAP、ABTS)來表示八角籽油的自由基清除能力。3種抗氧化能力都是基于單電子轉移能力，通過抗氧劑與指示劑的反應來分析抗氧劑的還原能力，并根據氧化劑的變色程度來評價抗氧劑的抗氧化能力[18-19]。結果表明極性物質的DPPH、ABTS+·強于Fe3+，且八角籽油的自由基清除能力高于普通食用油，可能與八角籽油中含有大量酚類化合物相關，此外，八角籽油和八角精油中含有相同的物質，如茴香腦、茴香醛等，這些物質在八角精油中具有較強的抗氧化能力[20]，這也可能與八角籽油強抗氧化能力相關。

3 結論

本研究中不同提取方式所得八角籽油不飽和脂肪酸含量占80%左右，總酚含量較高，八角籽油磷脂含量和常見食用油中磷脂含量接近。在兩種方式提取的八角籽油中都含有菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇和羊毛甾醇，β-谷甾醇占總甾醇含量的60%以上。八角籽油中僅有δ-生育酚，這可能是八角籽油特有的。索氏提取和冷榨對八角籽油的脂肪酸組成及含量影響較小，但對脂溶性成分影響較大，其中的影響機理還需要進一步研究。兩種方式提取的八角籽油均具有脂肪酸不飽和程度高、總酚含量高、僅有δ-生育酚的存在形式，具有較強的抗氧化能力。索氏提取八角籽油和冷榨八角籽油相比，具有過氧化值低、總酚、總甾醇、生育酚含量高、磷脂含量低、出油率高的優點。綜上，八角籽油在新型食用調味油脂開發及脂質營養方面具有較大的開發價值。