ADP-核糖基化樣因子15與過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α基因單核苷酸多態(tài)性與糖尿病腎臟疾病的相關(guān)性研究

凃影葉，張洪江，2，康淳，杜飛，2，崔佳慧，邵薇，2，袁志敏，王偉杰，楊康鵑*

糖尿病腎臟疾病（diabetic kidney disease，DKD）是2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）最常見的并發(fā)癥之一，在T2DM中DKD的發(fā)生率和死亡率僅次于心臟大血管病變［1］，遺傳因素是其主要的發(fā)病機(jī)制之一。2009年RICHARDS等［2］通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，ADP-核糖基化樣因子15（ADP-ribosylation factorlike 15，ARL15）基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）rs4311394的 G與 T2DM相 關(guān)，且攜帶G的個(gè)體與低水平血漿脂聯(lián)素相關(guān)。近年來(lái)李璦彤［3］研究發(fā)現(xiàn)，攜帶過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator receptor γ coactivator 1 α，PGC-1α）基因SNP rs7656250-C因子與延邊地區(qū)人群T2DM及合并大血管病變高度相關(guān)，具有顯性遺傳模式特征。

目前，關(guān)于ARL15和PGC-1α基因的rs4311394、rs7656250位點(diǎn)聯(lián)合作用與DKD患病關(guān)聯(lián)性研究尚未見報(bào)道。本研究將針對(duì)上述兩個(gè)基因SNP與DKD關(guān)系進(jìn)行探究，旨在從基因角度分析DKD發(fā)生情況，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018—2019年于延邊大學(xué)附屬醫(yī)院和延吉市醫(yī)院確診的朝鮮族和漢族T2DM患者393例（記為T2DM組）、DKD患者90例（記為DKD組），同期選取在延邊大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行單位體檢的健康人268例〔記為糖耐量正常組（NGT組）〕。受試者均來(lái)自延邊朝鮮族自治州，并在此居住10年以上；個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系。本研究經(jīng)延邊大學(xué)倫理委員會(huì)審批，受試者均對(duì)本研究知情同意。

T2DM組納入標(biāo)準(zhǔn)［4］：空腹血糖（FPG）≥7.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊類型糖尿病。

DKD組納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《糖尿病腎病防治專家共識(shí)（2014年版）》［5］中的DKD診斷標(biāo)準(zhǔn)；估計(jì)腎小球?yàn)V過率（eGFR）< 60 ml·min-1·（1.73 m2）-1。排除標(biāo)準(zhǔn)：由其他原發(fā)病變導(dǎo)致的腎臟損傷。

NGT組納入標(biāo)準(zhǔn)：FPG 3.9～6.1 mmol/L，血脂、肌酐（Cr）均在參考范圍。

NGT組中漢族137例，朝鮮族131例；T2DM組中漢族205例，朝鮮族188例；DKD組中漢族55例，朝鮮族35例。

1.2 生理、生化指標(biāo)采集方法 受試者均在空腹、凈重狀態(tài)下測(cè)量身高（cm）、體質(zhì)量（kg）、腰圍（cm）、臀圍（cm），計(jì)算并記錄其體質(zhì)指數(shù)（BMI）及腰臀比（WHR）。

取受試者清晨空腹靜脈血2 ml，1 609×g離心10 min 10 s分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)FPG、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、Cr、尿素氮（BUN）及尿酸（UA）；采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清ARL15、脂聯(lián)素蛋白水平。

鑒于PGC-1α蛋白含量在不同組織器官中的表達(dá)差異較大，且外周血中PGC-1α蛋白含量的干擾因素較多，無(wú)法精準(zhǔn)控制變量，因此未對(duì)PGC-1α蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)［6-7］。

1.3 DNA的提取 采用EDTA抗凝管收集外周血2 ml用于基因檢測(cè)，操作流程嚴(yán)格按照AxyGene小量全血基因組DNA提取試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行，詳細(xì)提取流程參考本課題組前期研究［3］。隨后進(jìn)行1%瓊脂糖電泳，并對(duì)DNA濃度及純度進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 DNA提取結(jié)果 加樣電泳后的膠膜在紫外分光光度計(jì)下有熒光條帶顯示，表明DNA提取有效。

2.2 PCR結(jié)果 圖1為ARL15基因rs4311394位點(diǎn)的4個(gè)樣品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為91 bp；圖2為PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)的4個(gè)樣品，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為75 bp。

圖1 rs4311394 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Figure 1 The amplification product result of rs4311394

圖2 rs7656250 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Figure 2 The amplification product result of rs7656250

2.3 測(cè)序結(jié)果 751例研究對(duì)象DNA測(cè)序結(jié)果：ARL15基因rs4311394位點(diǎn)和PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果見圖3～4，其中rs4311394位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果采用的是其互補(bǔ)鏈，測(cè)序圖中野生型位點(diǎn)T對(duì)應(yīng)為統(tǒng)計(jì)結(jié)果中的A，突變型位點(diǎn)C對(duì)應(yīng)為統(tǒng)計(jì)結(jié)果中的G。

圖3 ARL15基因rs4311394位點(diǎn)測(cè)序圖Figure 3 Sequence map of the SNP rs4311394 of ARL15 gene

圖4 PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)測(cè)序圖Figure 4 Sequence map of the SNP rs7656250 of PGC-1α

2.4 等位基因頻率、基因型頻率分析

2.4.1 NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率分析 NGT組人群3種基因型分布經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P>0.05），具有群體代表性。

NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1～2。

表1 NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 1 Comparison of allele and genotype frequencies of rs4311394 in ARL15 in Yanbian Korean and Han individuals in NGT group

表2 NGT組漢族和朝鮮族人群PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of allele and genotype frequencies of rs7656250 in PGC -1α in Yanbian Korean and Han individuals in NGT group

2.4.2 三組ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較 三組ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3～4。

表3 三組ARL15基因rs4311394位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 3 Comparison of allele and genotype frequencies of rs4311394 in ARL15 in three groups

表4 三組PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較〔n（%）〕Table 4 Comparison of allele and genotype frequencies of rs7656250 in PGC -1α in three groups

2.4.3 三組ARL15、PGC-1α基因聯(lián)合位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較 三組ARL15、PGC-1α基因聯(lián)合位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表5。

表5 三組ARL15、PGC-1α聯(lián)合基因型與疾病的關(guān)聯(lián)分析〔n（%）〕Table 5 Association analysis of two SNPs combined genotypes of ARL15 and PGC-1α and diseases in three groups

2.4.4 受試者ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)基因型與生理、生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)不同基因型者FPG、脂聯(lián)素水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中攜帶PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)CT基因型受試者FPG水平高于CC、TT基因型受試者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；攜帶PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)CT、TT基因型受試者脂聯(lián)素低于CC基因型受試者，TT基因型受試者脂聯(lián)素低于CT基因型受試者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表6～7。

表6 受試者ARL15基因rs4311394位點(diǎn)基因型與生理、生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析〔M（P25，P75）〕Table 6 Association analysis of the genotype of rs4311394 in ARL15 with physiological and biochemical indices

表7 受試者PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)基因型與生理、生化指標(biāo)的關(guān)聯(lián)分析Table 7 Association analysis of the genotype of rs7656250 in PGC -1α with physiological and biochemical indices

2.5 三組ARL15、脂聯(lián)素比較 三組ARL15、脂聯(lián)素比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中T2DM組患者脂聯(lián)素低于NGT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；DKD組患者ARL15、脂聯(lián)素高于NGT組、T2DM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表8。

表8 三組ARL15、脂聯(lián)素比較〔M（P25，P75）〕Table 8 Comparison of levels of ARL15 and adiponectin in three groups

2.6 DKD組患者ARL15與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，ARL15與BMI、WHR、FPG、TC、TG、HDL-C、LDL-C、Cr、BUN、UA無(wú)相關(guān)關(guān)系，與脂聯(lián)素呈正相關(guān)（P<0.05），見表9。

表9 DKD組患者ARL15與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 9 Association analysis between ARL15 and biochemical indices in DKD group

3 討論

T2DM是一種以體內(nèi)糖、脂代謝紊亂為特征的代謝性疾病，體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖、胰島素抵抗以及血脂異常是其一系列并發(fā)癥出現(xiàn)的主要原因［8］。近年來(lái)，盡管系統(tǒng)性降壓和降糖治療使得包括心血管疾病及糖尿病足在內(nèi)的T2DM并發(fā)癥減少了60%～70%，但DKD的發(fā)病率依然居高不下，成為T2DM患者主要的死亡原因之一［9］。DKD早期，高血糖導(dǎo)致腎小球高濾過、腎小球系膜擴(kuò)張、蛋白尿及腎小球毛細(xì)血管基膜增厚，隨著病程進(jìn)展，腎小球?yàn)V過率降低，腎小球及腎小管間質(zhì)纖維化，最終導(dǎo)致腎衰竭。目前，對(duì)于DKD發(fā)病機(jī)制的研究尚不完全，主要認(rèn)為高血糖可通過多種途徑參與DKD的發(fā)生發(fā)展，包括異常代謝、血管生成素的過度表達(dá)、糖基化終末產(chǎn)物的生成等［10］。

CUI等［11］研究結(jié)果顯示，中國(guó)延邊地區(qū)朝鮮族人群中ARL15基因rs26770位點(diǎn)的GG基因型與T2DM患病高度相關(guān)。GAYATHRI等［12］研究結(jié)果顯示，PGC-1α基因Gly482Ser多態(tài)性與亞洲印度人罹患DKD相關(guān)。既往研究還顯示，ARL15和PGC-1α的聯(lián)合作用與血漿中脂聯(lián)素水平密切相關(guān)［3］，而脂聯(lián)素與T2DM及DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［13］。因此，筆者推斷ARL15和PGC-1α的聯(lián)合作用與DKD的發(fā)生之間可能存在相關(guān)性，且多位學(xué)者發(fā)現(xiàn)在非洲西部、亞洲地區(qū)人群以及非裔美國(guó)人體內(nèi)血漿脂聯(lián)素水平與腎臟功能存在關(guān)聯(lián)性［14-16］，為本研究設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，認(rèn)為可能與延邊地區(qū)朝鮮族與漢族人群通婚現(xiàn)象比較普遍，且未將家族譜系列入篩選指標(biāo)，故在后續(xù)研究中將朝鮮族與漢族人群進(jìn)行合并分析，將疾病情況作為主要分組依據(jù)。本研究結(jié)果還顯示，三組ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)的等位基因頻率與基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且上述兩個(gè)位點(diǎn)的聯(lián)合基因型在三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明ARL15基因rs4311394位點(diǎn)與PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)并不是導(dǎo)致DKD與T2DM患者發(fā)病的直接因素。

在T2DM及DKD患者體內(nèi)，血糖、血脂異常同時(shí)存在，有研究表明，在高糖環(huán)境中PGC-1α水平明顯下降，與腎皮質(zhì)線粒體活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成增加、蛋白尿增多、腎小球硬化及系膜增生呈相關(guān)性［17］。同時(shí)，體內(nèi)低水平的PGC-1α還可使蛋白-線粒體分裂蛋白（DRP-1）表達(dá)增加，導(dǎo)致線粒體的重構(gòu)，并與TG、TC升高相互促進(jìn)，進(jìn)一步加重腎臟病變。近期研究發(fā)現(xiàn)，提高PGC-1α的活性是治療急性腎損傷和慢性腎臟疾病的有力措施之一［18］。

IWABU等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖情況下，PGC-1α的表達(dá)下降與脂聯(lián)素及其受體水平的降低、線粒體功能失調(diào)存在因果關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，NGT組漢族和朝鮮族人群ARL15基因rs4311394位點(diǎn)、PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)等位基因頻率、基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而攜帶PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)CT基因型受試者FPG水平高于CC、TT基因型受試者；攜帶PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)CT、TT基因型受試者脂聯(lián)素低于CC基因型受試者，TT基因型受試者脂聯(lián)素低于CT基因型受試者。有研究表明，脂聯(lián)素水平與血糖值呈負(fù)相關(guān)［3］，T2DM與DKD患者體內(nèi)脂聯(lián)素水平降低，脂肪細(xì)胞的分泌與血糖水平增高，而體內(nèi)糖、脂代謝紊亂是DKD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵一環(huán)，提示PGC-1α基因rs7656250-T可能為T2DM和DKD患者發(fā)病的影響因素之一。

本研究結(jié)果顯示，T2DM組脂聯(lián)素低于NGT組；DKD組ARL15、 脂 聯(lián) 素 高 于NGT組、T2DM組；Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，ARL15與脂聯(lián)素呈正相關(guān)。NANAYAKKARA等［20］研究結(jié)果也證實(shí)了，在慢性腎臟病患者中脂聯(lián)素水平與eGFR之間存在負(fù)相關(guān)，而PALMER等［22］研究結(jié)果顯示，腎功能下降率（即eGFR的斜率）與包括腎小球硬化和系膜溶解在內(nèi)的腎小球病變高度相關(guān)。一項(xiàng)最近的研究結(jié)果顯示，40%～50%的DKD患者在沒有出現(xiàn)蛋白尿的情況下出現(xiàn)了eGFR的降低，表明在DKD的發(fā)生發(fā)展中，eGFR可能是一個(gè)更為敏感的臨床指標(biāo)［22］。當(dāng)DKD患者體內(nèi)血清脂聯(lián)素水平上調(diào)時(shí)，eGFR呈下降的趨勢(shì)，表現(xiàn)為腎臟功能的減退。

本研究尚存在一定的局限性。首先，在研究對(duì)象方面，由于臨床數(shù)據(jù)的不足，樣本的生理、生化指標(biāo)采集并不充分，且在以民族為分組的分析中未將家系作為排除指標(biāo)，這可能是導(dǎo)致ARL15基因rs4311394位點(diǎn)與PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)在延邊地區(qū)朝鮮族與漢族中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的原因之一。其次，由于PGC-1α蛋白的特殊性，本研究未對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，下一步本課題組將繼續(xù)查閱文獻(xiàn)，以期在后期試驗(yàn)中可以加入這項(xiàng)指標(biāo)。

綜上所述，本研究雖然未發(fā)現(xiàn)ARL15、PGC-1α基因SNP與T2DM、DKD的相關(guān)關(guān)系，但一定程度上證明了攜帶PGC-1α基因rs7656250位點(diǎn)的CT、TT基因型人群體內(nèi)脂聯(lián)素水平明顯降低，推測(cè)rs7656250-T可能為T2DM和DKD患病的影響因素，為T2DM及DKD的遺傳易感性提供一定的遺傳學(xué)理論依據(jù)。

作者貢獻(xiàn)：凃影葉主要負(fù)責(zé)研究方案的設(shè)計(jì)、全程參與實(shí)驗(yàn)的操作、最終數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及論文的撰寫；張洪江協(xié)助進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，處理數(shù)據(jù)；康淳、杜飛、崔佳慧、邵薇和袁志敏協(xié)助數(shù)據(jù)收集，進(jìn)行論文的校正，英文的修訂；王偉杰和楊康鵑對(duì)文章的可行性進(jìn)行分析，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。

本研究鏈接：

近年來(lái)，隨著糖尿病確診人數(shù)的逐年攀升，糖尿病腎臟疾病（DKD）的發(fā)病率也從25.4%上升到27.1%，是1型糖尿病的主要死因，而在2型糖尿病中DKD的發(fā)生率和死亡率也僅次于心臟大血管病變。DKD作為一種由長(zhǎng)時(shí)間高血糖、胰島素抵抗和血脂紊亂而引發(fā)的腎臟微血管病變，病變初期，體內(nèi)長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致腎小球高濾過，腎小球入球小動(dòng)脈擴(kuò)張。隨著病程進(jìn)展，逐漸出現(xiàn)腎小球毛細(xì)血管基底膜的增厚以及腎間質(zhì)的纖維化，最終導(dǎo)致終末期腎衰竭的發(fā)生。根據(jù)目前的研究，DKD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，主要與糖代謝紊亂、血流動(dòng)力學(xué)異常、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激及遺傳因素相關(guān)，由于DKD是一種多基因遺傳病，故遺傳因素在DKD的遺傳易感性上起重要作用。