siRNA-ATF3表達載體對人膠質母細胞U373MG的作用研究

馬斯奇 孫逸杰 朱旭強 李雪元 吳立新 閆東明

鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052

膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是發生最為廣泛且最具惡性的一類中樞神經系統（CNS）腫瘤，在所有神經膠質腫瘤（gliomas）中，其占比為60%，每10萬人中5人患病，預后差，即便實施積極的綜合干預，基本每個GBM患者皆會復發，其后的中位生存期只有5～7個月［1-3］。因此，探討GBM形成、發展，還有遷移、侵襲的相關機制備受醫學領域重視。本研究制備siRNA-ATF3表達載體，并轉染U373MG細胞株，以熒光定量PCR和Western blot檢測篩選出有效的siRNA-ATF3表達載體，以免疫細胞化學法檢測轉染siRNA-ATF3表達載體的U373MG細胞株中ATF3、Maspin和MMP2的蛋白表達量，旨在分析在GBM組織形成、進行、遷移、浸侵與預后評估方面，MMP2、Maspin與ATF3所發揮的影響，為臨床治療GBM開辟新路徑。

1 材料與方法

1.1實驗材料采用上海細胞生物研究所和美國Invitrogen公司分別購得U373MG細胞株和純化質粒pSilencer。胰蛋白酶、限制性內切酶（HindⅢ、BamHⅠ）、質粒超純提取試劑盒、連接試劑盒、去內毒素質粒抽提試劑盒、小量提取質粒試劑盒、LipofectmineTM2000、RNA提取試劑Trizol和熒光定量PCR試劑盒均為Invitrogen公司（USA）產品，質粒超純提取試劑盒、細胞裂解液和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自中國上海碧云天生物技術研究所，TaqDNA聚合酶購自日本Takara公司，實時熒光定量PCR（RTPCR）引物由中國上海生工生物工程技術有限公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1 U373MG細胞中ATF3 siRNA的構建、篩選與鑒定

1.2.1.1 表達載體pSilencer/siRNA-ATF3的構建：參考相關研究成果，同時借助設計軟件，設計合成得到3對63 bp充分互補的序列，兩端分布著BamHⅠ與HindⅢ黏性末端識別序列，待停止退火，生成的雙鏈物質在不依賴酶切下能夠實現載體pSilencer2.1 U6的直接連入。

siR1：

5'-GATCCGAGC TGAGG TTTGCCATCCTTCAA GAGAGGATGGCAAACCTCAGCTCTTTTTTGGAA-3'，

5'-AGCTTTTCCAAAAAAGAGCTGAGGTTTGCC ATCCTCTCTTGAAGGATG GCAAACCTCAGCTCG-3'；

siR2：

5'-GATCCGAGGCGA CGAGAAAGAAATTT CAA GAGAATTTCTTTCTCGTCGCCTCTTTTTTGGAAA-3'，

5'-AGCTTTTCC AAAA AAGAGGCGACGAGAA AGAAATTCTTGAAATTTCTTTCTCGTCGCCTCG-3'；

siR3：

5'-GATCCGAAGAAGGAGAAGACGGAGTTCAA GAGACTCCGTCTTCTCCTTCTTCTTTTTTGGAAA-3'，

5'-AGCTTTTCCAAAAAAGAAGAAGGA GAA G ACGGAGTCTCTTGAACTCCGTCTTCTCCTTCTTCG-3'

由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。退火片段與pSilencer2.1 U6載體連接反應、酶切，在1%瓊脂糖凝膠中上樣酶切產物、電泳，膠塊回收，按照說明書嚴格開展各項操作。回收載體定量，DNA連接反應，連接產物轉化，借助小量提取質粒技術，完成對細菌培養物內質粒的提取，之后為鑒定酶切產物操作。

1.2.1.2 在U373MG細胞中檢測前體表達載體干擾表現

1.2.1.2.1 細胞培養、轉染：先行細胞復蘇處理，同時對細胞量進行統計，再移至培養箱（100%濕度、5%CO2、37℃）內培養。待細胞回縮、間隙變大，細胞開始變圓時，培養液終止消化。1 000 r/min離心5 min，在新培養瓶里內轉移種植，2～3 d后達到80%～90%的細胞匯合度，開始進入傳代環節。按轉染試劑盒步驟嚴格操作。轉染后24 h后求解轉染效率（=表達熒光的細胞量/總細胞量×100%）。

1.2.1.2.2 RT-PCR和Western blot檢測檢測pSilencer/siR-ATF3表達載體對ATF3表達水平的影響：RTPCR引物序列如下：正向序列：5’CCTCGGAAGT GAGTGCTTCT3’；反向序列：5’ATGGCAAACCTCAG CTCTTC3’。細胞的裂解、凝膠電泳、電轉膜、封閉、結合一抗、結合二抗，化學發光試劑檢測，顯影。

1.2.2 免疫細胞化學：轉染加藥后細胞爬片，4%多聚甲醛固定30 min，Triton X-100（0.25%）于室溫中對標本實施10 min孵育；室溫中，通過動物血清（10%）行0.5 h封閉處理，一抗4℃過夜，二抗室溫下1 h（或37℃，30 min）；DAB顯色，梯度酒精脫水，二甲苯透明20 min，中性樹膠封固。

1.2.3 實驗分組：共分為5組：①Cell組：未進行處理；②Control-siRNA組：實施siRNA寡NT（核苷酸）片段轉染操作；③ATF3-siRNA組：實施ATF3-siRNA干擾片段轉染操作；④順鉑（DDP）組：用DDP干預；⑤ATF3-siRNA+DDP組：先進行ATF3-siRNA轉染，再用DDP干預。

1.3統計學處理數據分析工具為SPSS 23.0，數據以均數±標準差（±s）描述，通過t檢驗分析2組間兩樣本均數，通過方差分析（ANOVA）對比分析多組間兩樣本均數，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組ATF3 mRNA相對表達量比較RT-PCR測定pSilencer/siR-ATF3影響ATF3表達量，各組ATF3 mRNA相對表達水平由大至小的排序為siRControl組＞細胞組＞siR3-ATF3組＞siR1-ATF3組與siR2-ATF3組；對比siR1-ATF3組、siR2-ATF3組未見顯著差別（P>0.05），剩余各組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。pSilencer siR1-ATF3、siR2-ATF3表達載體能夠使基因ATF3于細胞U373MG內的mRNA表達量顯著減少（圖1）。

圖1各組ATF3 mRNA相對表達量比較Figure 1 Comparison of the relative expression of ATF3 mRNA in each group

2.2Western blot測定表達載體p Silencer/siRATF3影響ATF3表達量在ATF3相對表達水平方面，由低至高的排序為siR1-ATF3組、siR2-ATF3組＜細胞組、siR3-ATF3組與siR-Control組。對比siR1-ATF3組、siR2-ATF3組未見顯著差異（P>0.05），對比另3組也未見顯著差異（P>0.05），其余各組兩兩對比差異均有統計學意義（P<0.05）。表達載體pSilencer siR1-ATF3、siR2-ATF3能夠使細胞U373MG內基因ATF3的蛋白表達量顯著減少（圖2～3）。

圖2 各組ATF3蛋白表達情況Figure 2 ATF3 protein expression in each group

圖3 各組ATF3蛋白相對表達量比較Figure 3 Comparison of the relative expression of ATF3 protein in each group

參考RT-PCR以及WB結果可發現，pSilencer siR1-ATF3、pSilencer siR2-ATF3表達載體能夠使細胞U373MG內ATF3基因的表達量顯著減少。

2.3干預后U373MG細胞形態學變化借助倒置顯微鏡能夠觀察到，干預后2 d，Control-siRNA組及Cell組皆呈現為良好的細胞生長情況，呈現出清晰的細胞輪廓，細胞高密度分布，貼壁生長；但另3個組均呈現出不良的細胞生長情況，一些細胞含顆粒量提升，細胞為圓狀，并呈浮起表現，細胞散在分布，大量碎片分布于細胞附近，細胞增殖速率下降（圖4）。

圖4 干預前后U373MG細胞形態學表現（400×），A、B分別所示為細胞U373MG的正常形態、干預后細胞U373MG的形態Figure 4 U373MG cell morphology before and after treatment（400×）.A：The normal morphology of U373MG cells；B：The morphology of U373MG cells after treatment

2.4干預后免疫細胞化學測定MMP-2、ATF3與Maspin的表達量

2.4.1 各組ATF3的表達與分布：細胞核以及細胞漿內皆存在ATF3蛋白陽性表達現象，就蛋白的陽性細胞量而言，空白組、Control-siRNA組對比差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于Control-siRNA組、空白組，另3組皆呈顯著偏低表現（P＜0.05）；由多至少的排序為DDP組＞ATF3-siRNA組＞ATF3-siRNA+DDP組，3組間兩兩對比差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖5、8。

圖5 5組ATF3的表達（400×），陽性表達即黃色顆粒A：Cell組；B：Control-siRNA組；C：ATF3-siRNA組；D：順鉑組；E：ATF3-siRNA+順鉑組Figure 5 The expression of ATF3 in each experimental group（400×），yellow particles are positive expression.A：Cell group；B：Control-siRNA group；C：ATF3-siRNA group；D：Cisplatin group；E：ATF3-siRNA+cisplatin group

2.4.2 Maspin在各實驗組的表達及分布情況：此蛋白的表達場所以U373MG胞漿為主，也有小部分可見于胞核內。在陽性細胞量上，空白組、Control-siRNA組差異無統計學意義（P＞0.05）；陽性細胞量最多的為ATF3-siRNA組，其和Control-siRNA組、空白組對比，差異均有統計學意義（P＜0.05）；相較于空白組、Control-siRNA組，DDP與ATF3-siRNA+DDP組皆呈顯著偏少（P＜0.05）；DDP組、ATF3-siRNA組、ATF3-siRNA+DDP組兩兩對比差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖6、8。

2.4.3 各實驗組MMP2蛋白的表達和分布：細胞U373MG的胞漿與胞核內皆存在MMP2陽性表達表現，在陽性細胞量上，空白組與Control-siRNA組對比差異無統計學意義（P＞0.05）；相較于Control-siRNA組與空白組，另3組呈顯著偏少（P＜0.05）；陽性細胞量由多至少的排序為DDP組、ATF3-siRNA組、ATF3-siRNA+DDP組，3組兩兩對比差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖7～8。

圖6各實驗組Maspin的表達（400×），陽性表達即黃色顆粒A～E依次所指為Cell組、Control-siRNA組、ATF3-siRNA組、DDP組、ATF3-siRNA+DDP組Figure 6 Maspin expression in each experimental group（400×），yellow particles are positive expression.A：Cell group；B：Control-siRNA group；C：ATF3-siRNA group；D：Cisplatin group；E：ATF3-siRNA+cisplatin group

圖7各實驗組MMP2的表達（400×），陽性表達即黃色顆粒A～E依次所指為Cell組、Control-siRNA組、ATF3-siRNA組、DDP組、ATF3-siRNA+DDP組Figure 7 The expression of MMP2 in each experimental group（400×），yellow particles are positive expression A：Cell group；B：Control-siRNA group；C：ATF3-siRNA group；D：Cisplatin group；E：ATF3-siRNA+cisplatin group

2.4.4 ATF3、MMP-2與Maspin蛋白表達陽性率對比：由圖8可知，在MMP2與ATF3蛋白表達量上，5組基本相當，其中陽性表達率最高的為空白組、Control-siRNA組，二者相比差異無統計學意義；順鉑組其次，ATF3-siRNA組次之，最低的為ATF3-siRNA+DDP組。在Maspin蛋白陽性率方面，ATF3-siRNA組＞Control-siRNA組與空白組＞DDP組＞ATF3-siRNA+DDP組。

圖8 5組ATF3、Maspin和MMP-2蛋白表達陽性率比較Figure 8 Comparison of the positive rate of ATF3，Maspin and MMP-2 protein expression in each experimental group

3 討論

ATF3參與人體內諸多生理功能，含細胞穩態的維持、信號轉導途徑、修復損傷、細胞凋亡途徑、細胞黏附等［4-6］。很大部分細胞內ATF3表達量皆相對較低，但當細胞受到多種細胞外信號刺激時其表達大大增加［7］。研究證實，ATF3具備致癌性，可使細胞增殖速度提升，在諸多不同惡性腫瘤組織內均有過表達現象發生，與惡性腫瘤的遷移、浸侵及預后皆存在密切聯系［8］。HUANG等［9］研究表明ATF3過度表達可促進前列腺癌細胞PC-3的能動性及侵襲性。YIN等［10］發現，受到TGFp的誘導，人BC細胞內ATF3呈表達上調表現，之后會經由增強Snail、Slug等侵襲，加速因子轉錄，對細胞凋亡進行抑制，同時對癌細胞遷移施以促進作用。ISHIGURO等［11］發現于HT29人克隆癌細胞內，反義ATF3寡NT表達能夠使細胞侵襲、細胞黏附受抑，削弱HT29異種移植物的生長，促進感染小鼠存活率提升。JANZ等［12］經由敲除小干擾RNA途徑，使ATF3功能喪失，能夠對L540Cy與L428霍杰金淋巴瘤（HL）細胞變異與增殖施以有效抑制。前期研究［13］表明，ATF3低表達于正常腦組織內，但與Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤（GBMLGG）內ATF3表達與GBMLGG的病理分級呈正相關，證實ATF3過表達與GBMLGG演進、惡性水平存在緊密聯系。沉默ATF3基因抑制了膠質母細胞瘤細胞株U373MG的增殖，削弱細胞活性、促進細胞凋亡、阻滯細胞生長、抑制細胞轉移，并在體內實驗中明顯縮小了裸鼠移植瘤的體積。這些研究均表明ATF3表達促進了人癌細胞的增殖，沉默ATF3基因可有效抑制腫瘤發展、侵襲。本研究發現，轉染了ATF3-siRNA后，U373MG形態出現變化，一些腫瘤細胞呈圓形，并浮起，各細胞松散分布，增殖速率減慢，可發現顆粒于細胞內的含量增大，碎片分布于細胞附近的量也增多，與未實施ATF3-siRNA轉染時相比，U373MG生長變得不良。由此可見，對于GBM的U373MG株增生，ATF3-siRNA具抑制作用。ATF3-siRNA組、DDP組以及ATF3-siRNA+DDP組內的陽性細胞量，相較另2組皆呈偏少，在陽性細胞量方面，DDP組最多，其次為ATF3-siRNA組，最低的是ATF3-siRNA+DDP組，3組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05），說明siRNA-ATF3表達載體能有效抑制U373MG細胞的生長和增殖，順鉑可協同減少ATF3的表達。

研究表明Maspin是一種抑癌基因，常高表達于多種正常人體組織，但在多種惡性腫瘤中表達下調或不表達，常暗示預后不良［14-16］。MMP2是一種促癌基因，高表達于多種惡性腫瘤組織，如宮頸癌、腦GBMLGG、BC、肺癌、胰腺癌（PAAD）、結腸癌與肝癌等，此基因對腫瘤新生血管的產生具促進作用，可使腫瘤細胞浸潤以及轉移灶產生速度提升［17-18］。前期實驗［13］顯示，在正常腦組織內Maspin蛋白與mRNA表達量皆較高，MMP2表達量皆偏低，但在Ⅰ～Ⅳ級GBMLGG內Maspin表達水平較低，其表達在病理級別增加下不斷下降，其表達與GBMLGG病理分級呈負相關，MMP2的表達逐級增強，且其表達與膠質瘤病理分級呈正相關，與其他學者研究結果一致。本研究發現，沉默ATF3基因后，U373MG細胞株中MMP2陽性表達與ATF3表達相當，在陽性細胞量上，相較于空白組、Control-siRNA組，另3組皆偏少，最多的為DDP組，其次為ATF3-siRNA組，相對最少的為ATF3-siRNA+DDP組，3組間兩兩對比差異均有統計學意義（P<0.05），說明siRNA-ATF3表達載體可減少MMP2表達，順鉑可協同進一步減弱MMP2的表達；與空白組和Control-siRNA組相比，Maspin在ATF3-siRNA組表達最高，在順鉑組和ATF3-siRNA+順鉑組中的表達降低，說明siRNA-ATF3表達載體可增加Maspin表達。

本研究表明ATF3、Maspin和MMP2可能協同參與了U373MG細胞的生長和增殖，在膠質母細胞瘤的發生、進展、浸潤和轉移過程中可能存在ATF3和MMP2的相互調節、相互協同機制，而Maspin則抑制了其進展，同時siRNA-ATF3表達載體可作為治療抑制膠質母細胞瘤生長增殖的一種有效手段。