線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征的分子生物學(xué)特征

吳世陶 劉 方 石偉偉 張 敏 李建章 劉恒方△

1）鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450052 2）鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450003

線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作（mi?tochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS）是由于線粒體DNA（mtDNA）或核DNA（nDNA）突變、導(dǎo)致線粒體的結(jié)構(gòu)和功能異常、細(xì)胞供能不足引起的一組臨床綜合征［1］。MELAS綜合征發(fā)病年齡早、臨床表現(xiàn)復(fù)雜、診斷困難，肌肉病理對(duì)其診斷具有重要價(jià)值，但其為有創(chuàng)性檢查，且兒童患者配合不佳，有一定的局限性。現(xiàn)在已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，基因檢測(cè)是診斷MELAS綜合征的金標(biāo)準(zhǔn)，且是一種無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確的方法［2］。ME?LAS綜合征約95%為mtDNA突變，5%為nDNA突變，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)與MELAS綜合征相關(guān)的mtDNA突變有40多種，約80%為3243 A＞G突變，其他突變位點(diǎn)有3271 T＞C、1642 G＞A、3252 A＞G、3260 A＞G、3291 T＞C、8344 A＞G、8993 T＞G、9176 T＞C和13513 G＞A等［3-5］。目前，國(guó)外研究方向主要為尋找新的突變位點(diǎn)、分析基因突變的發(fā)病機(jī)制、研發(fā)新藥及基因治療等［6-7］，這是一項(xiàng)長(zhǎng)期工程、需要積累大量的MELAS綜合征患者。相比之下，國(guó)內(nèi)對(duì)MELAS綜合征基因突變位點(diǎn)、流行病學(xué)、突變類型與表型的異質(zhì)性等研究相對(duì)較少。本研究分析42例MELAS綜合征患者及親屬的基因測(cè)序結(jié)果，分析MELAS綜合征的熱點(diǎn)突變、新發(fā)突變及不同組織的突變率等分子生物學(xué)特征。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2011-01—2020-01鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)肌肉病理和基因測(cè)序同時(shí)確診的42例MELAS綜合征患者及親屬的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)、肌肉病理和基因測(cè)序等資料，其中男22例，女20例，年齡4～42歲，病程2個(gè)月～11 a。本研究獲得鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2肌肉病理患者或監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，局麻下獲得骨骼肌標(biāo)本，根據(jù)病情取材部位為肱二頭肌或腓腸肌。新鮮標(biāo)本分兩部分，一部分行肌肉組織病理染色，另一部分行電鏡檢查。新鮮肌肉標(biāo)本經(jīng)液氮冷卻的異戊烷迅速冷凍，80℃保存，染色時(shí)制成8μm冷凍切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）、改良Gomori（MGT）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶（NADH）、細(xì)胞色素C氧化酶（COX）、過(guò)碘酸雪夫氏（PAS）和油紅O（ORO）染色，顯微鏡200倍下進(jìn)行病理分析。

1.3基因測(cè)序?qū)?2例MELAS綜合征患者及親屬的外周血和新鮮尿液同時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序，送至武漢康圣環(huán)球醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳后產(chǎn)生清晰可見(jiàn)、大小符合預(yù)期的條帶，首先采用Sanger法對(duì)3243 A＞G、3252 A＞G、3271 T＞C和13513 G＞A常見(jiàn)突變位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序。如果常見(jiàn)突變位點(diǎn)陰性時(shí)，應(yīng)用二代測(cè)序檢測(cè)線粒體DNA全長(zhǎng)，對(duì)于明確的致病突變，采用Sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用秩和檢驗(yàn)比較血液和尿液中線粒體DNA的突變率。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1肌肉病理42例患者改良Gomori染色可見(jiàn)較多破碎紅纖維，見(jiàn)圖1。

圖1 肌肉病理（×200）Figure 1 Muscle pathology（×200）

2.2基因測(cè)序42例MELAS綜合征患者及親屬進(jìn)行基因測(cè)序，42例患者均發(fā)現(xiàn)存在mtNDA突變。共發(fā)現(xiàn)30例患者存在3243 A＞G突變，血液檢出25例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率為22.15%～100%（35.82±11.26）%；尿液檢出30例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率為38.46%～100%（63.57±20.85）%；發(fā)現(xiàn)3271 T＞C突變3例，13513 G＞A突變3例，1642 G＞A、3093 C＞G、3256 C＞T、3302 A＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變分別1例。20例患者的親屬存在相同的基因突變位點(diǎn)，其中17例患者的母親、外婆、舅舅、兄弟姐妹或兒女存在相同的3243 A＞G突變位點(diǎn)，3例患者的母親分別存在相同的3271 T＞C、3302 A＞G、3697 G＞A突變位點(diǎn)。患者1發(fā)生3243 A＞G突變，外周血突變率為52.38%，尿液細(xì)胞突變率為100%；患者1的母親發(fā)生3243 A＞G突變，外周血突變率為9.11%，尿液細(xì)胞突變率為59.38%，母親無(wú)臨床癥狀，為攜帶者（圖2）。患者15發(fā)生3093 C＞G突變，外周血突變率為52.68%，尿液細(xì)胞突變率為100%（圖3）。患者16發(fā)生13513 G＞A突變，外周血突變率為77.61%；尿液細(xì)胞突變率為100%，為純質(zhì)性突變（圖4）；患者17出現(xiàn)3697 G＞A突變，外周血和尿液細(xì)胞的突變率均為100%；母親的尿液細(xì)胞存在相同的3697 G＞A突變，突變率為21.15%，母親沒(méi)有臨床癥狀，為攜帶者（圖5）；患者20發(fā)生3271 T＞C突變，外周血突變率為69.84%；尿液細(xì)胞突變率為100%，為純質(zhì)性突變；患者20的母親外周血未發(fā)生3271 T＞C突變；尿液細(xì)胞發(fā)生3271 T＞C突變，突變率為17.28%，有臨床表現(xiàn)（圖6）；患者34發(fā)生15242 G＞A突變，外周血突變率為42.75%；尿液細(xì)胞突變率為49.53%（圖7）。所有患者的父親均未發(fā)現(xiàn)基因突變。與外周血的線粒體DNA突變率相比，尿液細(xì)胞的突變率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖2 患者1的基因測(cè)序結(jié)果Figure 2 The gene sequencing results of case 1

圖3 患者15的基因測(cè)序結(jié)果Figure 3 The gene sequencing results of case 15

圖4 患者16的基因測(cè)序結(jié)果Figure 4 The gene sequencing results of case 16

圖5 患者17的基因測(cè)序結(jié)果Figure 5 The gene sequencing results of case 17

圖6 患者20的基因測(cè)序結(jié)果Figure 6 The gene sequencing results of case 20

圖7 患者34的基因測(cè)序結(jié)果Figure 7 The gene sequencing results of case 34

3 討論

人類mtDNA全長(zhǎng)16 569 bp，為雙鏈閉式環(huán)狀分子，其內(nèi)環(huán)為輕鏈（L-strand），外環(huán)為重鏈（Hstrand），編碼22個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer RNA，tRNA）、2個(gè)核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）（12S、16S）和13個(gè)蛋白質(zhì)［8-9］。目前發(fā)現(xiàn)與MELAS綜合征相關(guān)的mtDNA基因突變有40多個(gè)，分別位于MT CO3、MTNDl、MT-ND4、MT-ND5、MT-CYB和MT-NC6，還位于tRNA和rRNA區(qū)域的MT-TLl、MT-TL2、MT-TV、MT-TF、MT-RNR2、MT-TK、MT-TQ和MT-TH，其中文獻(xiàn)報(bào)道最多的是MT-TLl基因［10-14］。人類的MTTLl基因全長(zhǎng)為75 bp（np3230-np3304），編碼tR?NALeu（UUR）基因，在線粒體內(nèi)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)亮氨酸，tR?NALeu（UUR）基因含有78個(gè)堿基，能夠識(shí)別UUA與UUG兩個(gè)密碼子［15-16］。目前報(bào)道有8個(gè)MT-TLl點(diǎn)突變與MELAS綜合征相關(guān)，其中3243 A>G是最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)［17］。EL-HATTAB等［18］報(bào)道約80%的MELAS綜合征患者為3243 A>G突變。本研究中71.43%（30/42）的患者發(fā)生3243 A>G突變，稍低于上述報(bào)道，但與PICARD等［19］報(bào)道54.6%～72.3%的MELAS綜合患者為3243 A>G突變基本一致。mtD?NA亮氨酸t(yī)RNA基因3243 A>G導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止，影響了tRNA的甲基化、氨酰化及蛋白質(zhì)合成，造成線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅰ和Ⅳ的活性出現(xiàn)缺陷，氧化磷酸化障礙、能量供應(yīng)不足，從而導(dǎo)致一系列的臨床癥狀［20］。本組30例3243 A>G突變患者主要表現(xiàn)為卒中樣發(fā)作、頭痛、癲癇、智能減退、聽(tīng)力下降、精神異常、身材矮小、不耐受疲勞、視力下降和多毛等。

既往研究報(bào)道MELAS綜合征患者約10%為3271 T＞C突變，其他突變占10%［21］。本組僅3例3271 T＞C，占7.14%（3/42），推測(cè)可能與人種有關(guān)，也可能與樣本量較小有關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外陸續(xù)報(bào)道了60余例13513 G＞A突變導(dǎo)致的MELAS綜合征［22-23］。本研究通過(guò)行mtDNA全長(zhǎng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，7.14%的患者出現(xiàn)13513 G＞A，是本組患者中第三大常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，提示可以將13513 G＞A作為MELAS綜合征的熱點(diǎn)突變進(jìn)行篩查。13513 G＞A位于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（nicotinamide adenine dinucleo?tide，NADH）5基因上，是最常見(jiàn)的mt DNA ND5所編碼的基因突變［24］。13513 G＞A突變主要可引起ME?LAS綜合征、Leigh綜合征以及MELAS-Leigh疊加綜合征，這些臨床表型可能與年齡有一定的關(guān)系。13513 G＞A突變引起的MELAS綜合征常見(jiàn)于成年人，而其所致的Leigh綜合征常見(jiàn)于嬰幼兒，MELASLeigh疊加綜合征較罕見(jiàn)。本研究中3例13513 G＞A突變，發(fā)病年齡分別為26、19.5和23歲，與既往報(bào)道一致［25］。

本研究除發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)外報(bào)道過(guò)的mtDNA 3243 A＞G、13513 G＞A、3302 A＞G、1642 G＞A、3271 T＞C和3256 C＞T突變位點(diǎn)以外［26］，還發(fā)現(xiàn)了3093 C＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變，這3個(gè)突變國(guó)外已經(jīng)報(bào)道［27-29］，而國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。患者15主要表現(xiàn)為頭痛、癲癇、聽(tīng)力下降，發(fā)生3093 C＞G突變，3093 C＞G位于16S rRNA亞基，突變時(shí)將導(dǎo)致16S rRNA亞基的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，造成線粒體氧化磷酸化障礙。患者17主要表現(xiàn)為卒中樣發(fā)作、智能減退、視力下降，發(fā)生3697 G＞A突變，其母親存在相同的3697 G＞A突變，但無(wú)臨床表現(xiàn)。MT-NDl編碼呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ，該酶是線粒體內(nèi)膜上完成電子傳遞過(guò)程的關(guān)鍵酶［30］。m3697位于MT-NDl區(qū)域，當(dāng)正常的G堿基突變?yōu)锳堿基時(shí)，導(dǎo)致第131位甘氨酸被錯(cuò)誤地翻譯成絲氨酸（p.Gly 131 Ser），改變了MT-ND1的空間結(jié)構(gòu)，從而影響NADH脫氫酶的活性，造成ATP合成減少、細(xì)胞能量供應(yīng)不足。患者34主要表現(xiàn)為智能減退、身材矮小、多毛、不耐受疲勞，發(fā)生15242 G＞A突變，m15242位于mtDNA MT-CYB基因上，當(dāng)正常的G堿基突變?yōu)锳堿基時(shí)，第166位甘氨酸密碼子（GGA）轉(zhuǎn)換成終止密碼子（AGA），導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄終止，線粒體氧化磷酸化發(fā)生障礙。在線粒體內(nèi)膜上，呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ是氧化磷酸化電子傳遞過(guò)程中的第二個(gè)酶，其突變或缺失會(huì)影響催化電子從還原型輔酶Q到細(xì)胞色素C的轉(zhuǎn)運(yùn)，且將質(zhì)子從線粒體內(nèi)膜轉(zhuǎn)移到膜外。呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ含有11個(gè)亞單位，1個(gè)由mtDNA編碼，10個(gè)由nDNA編碼，而線粒體細(xì)胞色素b（mitochondria cytochrome b，MT-CYB）是呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ中唯一由mtDNA編碼的亞基，是一種高度保守的疏水蛋白，含有2個(gè)血紅素基團(tuán)和8或9個(gè)跨膜區(qū)，MT-CYB與核心蛋白Ⅰ、Ⅱ共同構(gòu)成呼吸鏈復(fù)合物Ⅲ的中心成分［31］。因此，MT-CYB基因的突變或缺失將直接影響線粒體氧化磷酸化的過(guò)程。本組病例中3093 C＞G、3697 G＞A和15242 G＞A突變所致的MELAS綜合征是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道，國(guó)外關(guān)于這3個(gè)位點(diǎn)的突變也僅有少量報(bào)道，因此，這3個(gè)突變?cè)趪?guó)內(nèi)人群中導(dǎo)致的MELAS綜合征的臨床癥狀與突變率的關(guān)系無(wú)法考證，需要更多的病例積累，具體的發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究中30例患者發(fā)生3243 A＞G突變，血液檢出25例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率22.15%～100%（36.26±13.38）%；尿液檢出30例發(fā)生3243 A＞G突變，突變率38.46%～100%（59.49±22.67）%；與外周血的mtDNA突變率相比，尿液細(xì)胞的突變率顯著增高（P<0.05）。目前，尿液細(xì)胞的mtDNA突變率明顯高于外周的機(jī)制并不明確，有研究認(rèn)為血外周血細(xì)胞對(duì)能量需求大、分裂速度快，可能會(huì)自然選擇地淘汰mtDNA突變率高的細(xì)胞［32］。LAAT等［33］對(duì)8例3243 A＞G突變患者從剛出生時(shí)的外周血細(xì)胞到確診MELAS綜合征（相隔8～20 a）時(shí)的外周血細(xì)胞的突變率進(jìn)行縱向比較發(fā)現(xiàn)，外周血的mtDNA突變率進(jìn)行性降低，平均每年減少1.42%。有學(xué)者認(rèn)為存在于生命周期短的細(xì)胞、對(duì)細(xì)胞傷害較輕的mtDNA突變，不會(huì)對(duì)細(xì)胞生存產(chǎn)生壓力，允許突變的mtDNA積累等［34］。尿液細(xì)胞的DNA主要來(lái)源于腎臟和輸尿管的上皮細(xì)胞，雖然上皮細(xì)胞屬于分裂旺盛的細(xì)胞，但上皮細(xì)胞耗氧量小，允許突變的mtDNA積累，因此外周血的mtDNA突變率明顯低于尿液細(xì)胞。FIN?STERER等［35］等通過(guò)對(duì)比MELAS綜合征患者血液、尿液、唾液、肌肉細(xì)胞和毛囊的mtDNA突變率發(fā)現(xiàn)，血液、尿液和唾液細(xì)胞的mtDNA突變率較低，肌肉細(xì)胞的突變率最高，而尿液細(xì)胞的突變率與肌肉細(xì)胞相差無(wú)幾。但肌肉取材為有創(chuàng)性檢查，且不適用于無(wú)癥狀親屬的篩查。由于尿液無(wú)創(chuàng)、容易獲得、突變率高，可作為MELAS綜合征患者及親屬基因測(cè)序首選的標(biāo)本。

本研究共發(fā)現(xiàn)20例患者的母親、外婆、舅舅、兄弟姐妹或兒女存在相同的突變位點(diǎn)，父親均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，符合母系遺傳。由于受精卵中線粒體的只來(lái)源于卵細(xì)胞，mtDNA只能從母親傳遞給子女，然后由她的女兒傳遞給后代，mtDNA傳遞至兒子后即終止，父親不能將線粒體基因傳遞給后代，所以ME?LAS綜合征為母系遺傳。17例患者的母親或其他親屬的尿液細(xì)胞發(fā)生3243 A＞G突變位點(diǎn)，突變率24.34%～89.26%（45.82±14.18）%，其中15例有臨床表現(xiàn)，輕重不一，2例無(wú)臨床表現(xiàn)。閾效應(yīng)和異質(zhì)性可能是患者親屬發(fā)生基因突變但無(wú)臨床表現(xiàn)的原因。

MELAS綜合征為母系遺傳，3243 A＞G是最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)。臨床懷疑MELAS綜合征時(shí)，可先檢測(cè)3243 A＞G、3252 A＞G、3271 T＞C、8344 A＞G和13513 G＞A等熱點(diǎn)突變，這樣可確診約90%的患者，當(dāng)熱點(diǎn)突變陰性時(shí)再行mtDNA全長(zhǎng)基因測(cè)序，若仍為陰性，必要時(shí)可進(jìn)行nDNA測(cè)序，這是一種經(jīng)濟(jì)、有效的方法。尿液細(xì)胞的mtDNA突變率高于外周血，可作為MELAS綜合征患者及親屬基因測(cè)序首選的標(biāo)本。本研究還發(fā)現(xiàn)3697 G＞A、1642 G＞A和15242 G＞A突變?yōu)閲?guó)內(nèi)首次報(bào)道，豐富了國(guó)內(nèi)ELAS綜合征線粒體基因突變的特點(diǎn)。MELAS綜合征的發(fā)病機(jī)制是十分復(fù)雜的，受mtDNA和nDNA兩套遺傳體系共同調(diào)控，目前國(guó)外的研究重心逐漸從單個(gè)mtDNA突變位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到多個(gè)突變位點(diǎn)的復(fù)合突變研究，由mtDNA組到nDNA組突變的研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用和新技術(shù)的不斷發(fā)展，許多新的突變位點(diǎn)、復(fù)合突變和nDNA組突變將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，將有助于闡明MELAS綜合征的發(fā)病機(jī)制。對(duì)MELAS綜合征認(rèn)識(shí)的深入，也為該病的診治和遺傳咨詢提供依據(jù)。