谷氨酸草酰乙酸轉氨酶抑制腦損傷后炎癥反應的研究

張岱男 周世芳 肖 萌 馬順昌△

1）首都醫科大學附屬北京天壇醫院，北京 100070 2）河南省神經修復重點實驗室（新鄉醫學院第一附屬醫院），河南 衛輝 453100

創傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是最常見的神經系統損傷性疾病之一，僅次于四肢傷，主要因交通事故和暴力事件所致，對人類生命及生活質量造成嚴重威脅。按照TBI發生的時間和類型可分為原發性（直接）顱腦損傷和繼發性（間接）顱腦損傷，繼發性顱腦損傷引起的興奮性氨基酸毒性、顱內高壓、腦組織缺血缺氧、腦能量代謝紊亂等是導致后期高致死率、高致殘率的常見原因，與患者預后密切相關［1-2］。谷氨酸（GLU）作為中樞神經系統重要的快速興奮性神經遞質，過量產生可經N-甲基-D-天門冬氨酸鹽（NMDA）受體引起鈣離子超載與非NMDA受體通路增加炎癥損傷，加重神經功能損害、腦水腫和神經細胞凋亡等改變，是造成繼發性腦損傷病情加重的主要原因。TBI后炎性因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）表達升高介導的炎癥反應在繼發性顱腦損傷中發揮重要作用［3］。因此，如何尋找可靠的治療手段減輕炎癥反應，從而減少神經細胞變性、壞死，減輕繼發性腦損傷，提高患者的生存率，已成為神經科學領域研究的熱點和難點［4］。GLU與草酰乙酸（OxA）經谷氨酸草酰乙酸轉氨酶（GOT）催化產生天冬氨酸與α-酮戊二酸。研究發現，GOT降低外周血中谷氨酸濃度，是通過增強跨血腦屏障的谷氨酸穩態加速中樞神經系統的谷氨酸清除，進而降低其興奮性毒性，產生神經保護作用［5-6］。研究表明，GOT在缺血再灌注大鼠模型中減少梗死面積并短暫消除長時程增強（LTP）的抑制［7-8］。此外，GOT在卒中、阿爾茨海默病及其他神經退行性疾病的動物模型中均具有良好的神經保護作用［9-11］，但其對TBI患者中樞系統炎癥反應的影響目前尚不明確。本研究通過構建TBI大鼠閉合性顱腦損傷模型，觀察炎性細胞因子的釋放是否具有時間依從性，探討GOT能否抑制TBI后繼發性腦損傷的炎癥反應，以及向臨床轉化的潛力。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組及藥物干預健康成年雄性SD大鼠36只，體質量250～300 g，購自北京維通利華有限公司。將大鼠隨機分為3組，對照組（Sham組）12只，腦損傷組（TBI組）12只，GOT給藥組（GOT+TBI組）12只。TBI+GOT組經頸部皮下注射GOT 0.3 mg/kg，1次/d，連續注射1周；Sham組和TBI組注射等量生理鹽水，注射方式和注射次數與TBI+GOT組保持一致。

1.2大鼠腦損傷模型制作利用改良Feeney DM自由落體硬膜外撞擊法制作TBI模型：氯胺酮60 mg/kg腹腔注射麻醉SD大鼠，俯臥位固定，剃去大鼠毛發，消毒，沿中縫位置切開頭部皮膚，剝離軟組織和骨膜，于顱骨中線右側旁3 mm、人字縫前3 mm開一5 mm的圓形骨孔，硬膜保持完好，利用自由落體打擊裝置，將50 g砝碼從20 cm高處落下，撞擊置于硬腦膜上的圓錐，使其發生腦損傷，骨蠟封閉后，縫合頭皮。Sham組不做撞擊。

1.3標本制備模型制作成功后，分別于12 h、1 d、3 d、5 d取標本。在不同的時間點處死大鼠，取損傷的大腦組織，按照腦濕質量∶生理鹽水=1∶9的比例加入預冷的生理鹽水，冰上研磨，制備腦組織勻漿，3 000 r/min、4℃離心15 min，取上清液，80℃保存備用。

1.4檢測方法ELISA檢測細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的表達，按照試劑盒說明數書操作，加樣后，封板于37℃敷育90 min，洗3次，加入Biotinylated antibody工作液，37℃敷育90 min，洗3次，加入streptavidin-HRP工作液37℃敷育30 min，洗3次，加入TMB，37℃避光敷育5～30 min，期間觀察顯色情況，加入Stop solution，酶標儀檢測在450 nm處的各孔光密度（optical density，OD）。繪制標準曲線計算樣本中TNF-α和IL-6的濃度。

2 結果

ELISA檢測GOT對SD大鼠TBI后炎性因子的影響，與Sham組相比，TBI和TBI+GOT組腦組織中IL-6的表達在腦損傷后12 h、24 h顯著升高（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平；與TBI組比較，TBI+GOT組腦組織中IL-6的表達在腦損傷后12 h、24 h顯著降低（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平（表1、圖1）。與Sham組相比，TBI和TBI+GOT組腦組織中TNF-α的表達在腦損傷后12 h、24 h顯著升高（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平；與TBI組比較，TBI+GOT組腦組織中TNF-α的表達在腦損傷后12 h、24 h顯著降低（P＜0.05），第3天、第5天回歸至Sham組水平（表2、圖2）。

表1 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后IL-6在腦組織中的濃度變化（pg/g，±s）Table 1 Changes in the concentration of IL-6 in brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（pg/g，±s）

表1 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后IL-6在腦組織中的濃度變化（pg/g，±s）Table 1 Changes in the concentration of IL-6 in brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（pg/g，±s）

組別Sham組TBI組TBI+GOT組n IL-6 12 12 12 12 h 601.1±5.71 911.42±2.9 728.8±3.13 1 d 628.47±3.32 1230.44±18.63 986.85±6.85 3 d 609.49±6.11 610.53±17.75 642.35±47.01 5 d 621.94±7.44 607.69±15.48 608.12±33.01

圖1 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后IL-6在腦組織中的濃度變化Figure 1 Changes in the concentration of IL-6 in brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI

表2 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后TNF-α在腦組織中的濃度變化（±s，pg/g）Table 2 Changes in the concentration of TNF-αin brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（±s，pg/g）

表2 腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后TNF-α在腦組織中的濃度變化（±s，pg/g）Table 2 Changes in the concentration of TNF-αin brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI（±s，pg/g）

組別Sham組TBI組TBI+GOT組n TNF-α 12 12 12 12 h 716.83±10.6 808.81±3.79 770.39±5.68 1 d 709.27±4.35 1417.95±22.26 1060.72±307.41 3 d 710.83±1.58 723.84±30.15 697.21±15.05 5 d 721.95±4.89 736.15±37.05 704.92±27.28

圖2腦損傷12 h、1 d、3 d、5 d后TNF-α在腦組織中的濃度變化Figure 2 Changes in the concentration of TNF-αin brain tissue after 12h,1d,3d,5d after TBI

3 討論

TBI發病率逐年增高，已成為威脅人類生命及生活質量主要的創傷性疾病之一，是45歲以下個體死亡的主要原因［12-13］。TBI后繼發性腦損傷對預后具有決定性作用，其病理生理機制復雜，主要包括中樞神經系統能量代謝紊亂、神經功能障礙、顱內高壓、腦微循環紊亂等［14-15］。近年來，有學者發現創傷后炎性細胞因子被激活分泌，其介導的炎癥反應參與了腦損傷后病理生理演變的全過程［16-17］。因此，尋找可靠的治療手段減輕炎癥反應，減輕繼發性腦損傷，提高患者的預后，已成為神經病學及康復醫學領域研究的重點［4］。

本課題組前期的研究顯示，GOT作為外周谷氨酸清除系統對神經退行性疾病具有潛在的保護作用［9-11］，并且發現由GOT和草酰乙酸（Oxa）組成的基于外周血的清除系統在缺血再灌注大鼠模型中減少梗死面積［7-8］。GOT催化外周血谷氨酸與Oxa反應生成天冬氨酸和α-酮戊二酸，該反應為血漿中存在的可逆反應，其反應方向取決于底物間的相對濃度［18-19］。該酶化反應降低外周血中谷氨酸濃度，增加跨血腦屏障濃度梯度，當中樞系統細胞外液谷氨酸濃度病理性升高時，加速谷氨酸由中樞系統向外周轉運，從而降低中樞系統興奮性毒性［5］。

研究發現，顱腦損傷發生后，短時間內即可啟動炎癥反應，活化的小膠質細胞、巨噬細胞和中性粒細胞釋放各種炎性細胞因子，如TNF-α、IL-6，破壞血腦屏障，損傷血管內皮細胞，是導致繼發性腦損傷的重要原因［20-21］。此外，TBI后炎性細胞因子的超量表達還可導致鈣離子超載、氧化應激、細胞凋亡等損害性級聯反應，最終引起神經細胞的變性、壞死；其表達水平對創傷后病情評估、治療措施及預后都具有重要價值［22］。TNF-α是TBI后早期釋放的炎性因子，在中樞神經系統內主要由活化的巨噬細胞和T細胞產生，可激活小膠質細胞和星形膠質細胞，引起腦組織過度免疫損傷導致嚴重的神經毒性，加速神經細胞的變性、壞死［23］。IL-6在中樞神經系統內主要由有核細胞產生，如神經膠質細胞、B細胞、T細胞、血管內皮細胞等，其作為一種重要的炎性介質，在損傷早期的腦組織中顯著增高，參與繼發性腦損傷的過程［24］。TBI后血腦屏障受到破壞，外周血中的TNF-α和IL-6細胞因子通過受損的血腦屏障進入腦組織，同時中樞神經系統中星形膠質細胞和小膠質細胞分泌大量炎性細胞因子，導致中樞神經系統的炎性因子快速升高，激活損傷級聯反應，介導免疫損傷，腦血管微環境改變，毛細血管通透性增加，形成惡性循環，進一步加速神經細胞死亡［25-26］。本研究發現，顱腦損傷后腦組織炎性因子TNF-α和IL-6的表達水平顯著升高，24 h達到高峰，并于3 d后降低，其變化具有時間依從性。而給予GOT治療后TNF-α和IL-6的表達水平在12 h、24 h明顯降低，說明TNF-α、IL-6參與了TBI后的繼發性炎癥反應，且GOT干預后減少了腦組織炎性因子的釋放，抑制了大鼠中樞神經系統炎癥反應。

本實驗通過Feeney DM自由落體撞擊法制備TBI模型很好地模擬了臨床工作中TBI的損傷特點，研究發現TBI后腦組織炎性因子的釋放具有時間依從性，GOT能夠降低TBI后中樞神經系統炎性因子TNF-α、IL-6的表達水平。GOT可以減輕創傷性腦損傷后的中樞系統炎癥反應，可能有助于減輕繼發性腦損傷，改善預后。