培養基中附加6-BA長期繼代培養對蝴蝶蘭類原球莖活力及生理生化指標的影響

劉福平 陳淳 程小兵 鄭明瓊

摘 ?要：為了解培養基中附加6-BA長期繼代培養對蝴蝶蘭類原球莖（PLB）狀態的影響，以只添加3 mg/L的6-BA和不添加植物生長調節劑（對照）培養基分別繼代培養PLB 24個月，培養過程中觀測PLB活力指標，分析相關氧化、抗氧化和DNA生化指標。結果表明，第8個月2組PLB活力指標沒有顯著差異，第16個月6-BA組PLB分化率顯著升高，第24個月增值倍數和分化率分別顯著降低和極顯著降低，且PLB的玻璃化率較高;6-BA組PLB氧化脅迫水平在第8、第16個月都較對照低，第24個月較高，培養期間·OH相對含量和POD活性與氧化脅迫水平分別相向和反向消長;6-BA組PLB的DNA甲基化程度始終較對照低，增色效應到第24個月才降低。較強的氧化脅迫，·OH相對含量、H2O2和MDA含量提高，POD和CAT活性降低，以及DNA甲基化程度降低，與6-BA誘導PLB玻璃化有關。綜上分析，含6-BA培養基長期繼代培養蝴蝶蘭類原球莖，在培養中期可減緩類原球莖衰老，培養后期則加劇了衰老退化，所以在蝴蝶蘭類原球莖的繼代培養中，應適時調整細胞分裂素用量和控制繼代次數。

關鍵詞：蝴蝶蘭類原球莖;長期繼代;6-BA;活力;生理生化

Abstract： To understand the effects of 6-BA in media on the protocorm like body （PLB） of Phalaenopsis hybrida through long-term subculture， PLB was subcultured respectively on the media supplemented with only 6-BA （3 mg/L） and that without plant growth regulator （control） for 24 months. Some indexes of vitality， oxidation， antioxidant and DNA biochemistry of PLB were observed and analyzed during the subculture. The results showed that there was no significant difference in the PLB vitality indexes between the two groups at the 8th month. The differentiation rate of PLB in 6-BA group increased significantly at the 16th month. At the 24th month proliferation multiple and differentiation rate of PLB in 6-BA group decreased significantly and extremely significantly，?respectively， meantime the PLB had a higher hyperhydricity rate. The oxidative stress level of PLB in 6-BA group reduced than that in control group at the 8th and 16th months， but increased at the 24th month. Throughout this?subculture， changes of relative content of ·OH showed the similar trend with the oxidative stress level， and that of POD activity did conversely. The degree of DNA methylation in 6-BA group remained below that in the control， also the DNA hyperchromic effect was lower only at the 24 months. In?addition to?this，?PLB hyperhydricity induced by 6-BA was connected with the factors including stronger oxidative stress， the increase of the relative content of ·OH， contents of H2O2 and MDA， the decrease of POD and CAT activities， as well as the decrease of degree of DNA methylation. Based on the above analysis， it could be concluded that during the long-term subculture of P. hybrida PLB， 6-BA in media slowed down PLB senescence?in the middle stage of subculture， whereas it accelerated the?senescence in the later stage. Therefore， the amount of cytokinin in media should be adjusted in time and the times of subculture should be limited in the subculture of P. hybrida PLB.

Keywords： Phalaenopsis hybrida PLB; long-term subculture; 6-BA; vitality; physiology and biochemistry

蘭科植物組培類原球莖（PLB）在快速育苗、基因轉化、生物反應器的應用、人工種子研制、種質保存等方面具有相當應用潛力，在類原球莖的生產應用中，不可避免地進行頻繁繼代培養，同其他植物一樣，將導致無性系生理和遺傳上的衰老變異，一般認為是培養基植物激素在植物體內積累等因素作用的結果[1]。蝴蝶蘭或其他蘭科植物的組培類原球莖在含高濃度植物激素的培養基上培養，尤其經長期繼代培養無性系變異率很高是普遍現象，而且伴隨某些生理生化、遺傳指標的變化[2-5]。細胞分裂素在蝴蝶蘭組織培養中起主要作用，培養基采用單一細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）就足以增殖蝴蝶蘭類原球莖，效果理想，所使用或推薦6-BA濃度為1～6 mg/L[6-9]，也有研究者發現蝴蝶蘭類原球莖繼代增殖時外源激素并非必需[8，10-12]，劉福平等[8]將蝴蝶蘭完整類原球莖分別在含5?mg/L的6-BA和無激素培養基繼代，生成物為PLB，誘導率均為100%，顧德峰等[11]在無激素改良狩野培養基對5個品種蝴蝶蘭類原球莖擴繁20代，高汝勇等[12]在MS添加0.2%活性炭和10%的香蕉汁的無激素培養基，原球莖可繼代30次。為避免或減輕發生無性系變異，有些作者[6，13-15]建議蝴蝶蘭類原球莖的繼代擴繁培養基不加或少用激素。

目前研究植物長期繼代組培無性系各指標變化，一般以觀測初代培養物（或母株）的數據為對照。除了培養基的生長調節物質，外植體脫分化的細胞分裂方式、培養物染色體和分子水平自發變異的積累、離體培養條件自身對培養物的非生物脅迫等也是影響長期繼代組培無性系變異各指標變化的重要因素[1]，常規實驗設計無法有針對性地研究某一種因素（如某種植物生長調節物質）對長期繼代組培無性系變異的影響。鑒于蝴蝶蘭類原球莖繼代增殖對外源激素沒有嚴格要求，為研究激素對原球莖繁殖等的作用及機理提供了良好的實驗系統。本研究以無激素培養基（對照）和添加細胞分裂素（6-BA）的培養基分別對蝴蝶蘭類原球莖進行長期繼代培養，能夠單純地了解6-BA調節長期繼代類原球莖無性系相關指標變化的影響，較客觀地了解6-BA對長期繼代類原球莖衰老退化的作用機理。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrida）瓶苗由福建省亞熱帶植物研究所組培室提供。類原球莖（PLB）獲得方法同參考文獻[5]。

1.2 ?方法

1.2.1 ?繼代培養PLB實驗系統 ?PLB長期繼代培養方法，對照組為沒有添加植物生長調節劑的培養基，即1/2 MS+CW（椰子汁）20%（體積比，下同）+蔗糖2%，處理組培養基添加6-BA，即1/2?MS+6-BA 3.0 mg/L+ CW 20%+蔗糖2%。繼代轉接PLB每瓶起始鮮重均為3.00 g，每2個月繼代分瓶1次，共繼代分瓶11次，PLB共培養24個月。

1.2.2 ?PLB活力測定 ?在培養的第8個月（前期）、16個月（中期）、24個月（后期），挑選非玻璃化PLB檢驗增殖倍率、分化率。隨機取9瓶稱量每瓶PLB鮮重，除以起始鮮重（3.00?g）得增殖倍數。取PLB團剝離中等大小的單粒PLB，接種到分化培養基1/2?MS+6-BA 3.0?mg/L+NAA 0.5 mg/L+CW 20%+蔗糖2%，每瓶接種10粒，每處理觀測9瓶，培養2個月，PLB分化率=出芽長根PLB數/總PLB數×100%。

在實驗過程中，同時觀察繼代培養期間PLB玻璃化情況。從培養24個月的6-BA組PLB，挑選非玻璃化PLB分別接種到上述分化培養基（含6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L），培養2個月觀察PLB玻璃化情況，PLB玻璃化瓶數的發生率=出現玻璃化PLB的瓶數/觀察瓶數×100%，PLB玻璃化發生率=單一瓶內玻璃化的PLB數量/瓶內PLB總數×100%。

上述培養條件均同參考文獻[5]。

1.2.3 ?PLB生理生化指標分析 ?隨機選取培養第0、8、16、24個月的非玻璃化PLB進行生理生化指標分析。

總活性氧（T-ROS）水平、超氧陰離子（）生成速率、羥自由基（·OH）相對含量、過氧化氫（H2O2）含量、丙二醛（MDA）含量、總抗氧化（T-AOC）能力、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性、DNA胞嘧啶甲基化水平等10個指標分析方法見文獻[4-5]對應指標分析方法及引用文獻，單位均以每克鮮重表示。

DNA增色效應。參照曾碧慧等[16]和沈丹艷等[17]的方法稍作修改。取CTAB法提取的DNA 20?μL，溶于2.48 mL 0.08 mol/L的NaC1溶液中，在室溫（24.5?℃）下紫外分光光度計測定A260，然后DNA在94?℃的水浴上加熱，冰浴冷卻，測定A260，以[（A260， 94 ℃?A260， 24.5 ℃）/A260， 24.5 ℃]×100%作為DNA增色效應指標。

1.3 ?數據處理

培養期間同一培養時間點的6-BA組與對照組之間差異顯著性比較采用t檢驗法。對照組在不同培養時間觀測數據的組間差異顯著性分析按鄧肯氏新復極差測驗法。采用SPSS19.0軟件和Excel 2003軟件統計分析。

2 ?結果與分析

2.1 ?6-BA對長期繼代培養類原球莖活力及生理生化指標的效應

繼代培養對照為不添加6-BA的培養基，處理組培養基添加6-BA。蝴蝶蘭PLB在不同繼代培養時間的增值倍數和分化率見表1，初代PLB的增殖和分化情況見圖1A和圖1B;繼代培養PLB部分氧化指標變化見表2;繼代培養PLB的某些抗氧化指標見表3;繼代培養期間DNA胞嘧啶甲基化程度、DNA增色效應變化見表4。

根據上述結果，對繼代培養期間6-BA組與對照組PLB各指標進行對比分析。

（1）在培養第8個月，對照組PLB增殖倍數和分化率與初代均沒有顯著差異（表1），總活性氧水平顯著提高（表2），總抗氧化能力、DNA生化指標沒有顯著差異（表3、表4）。6-BA組PLB與對照組相比，增殖倍數和分化率沒有明顯差異（表1）;總活性氧水平、總抗氧化能力分別顯著降低和顯著升高，對應·OH相對含量較對照極顯著降低，3種抗氧化酶活性都顯著提高（表2、表3），DNA甲基化程度顯著降低（表4）。

（2）在培養第16個月，對照組PLB增殖倍數與第8個月相比沒有明顯變化，分化率顯著降低（表1），總活性氧水平和總抗氧化能力分別極顯著提高和極顯著降低（表2、表3），MDA含量、DNA甲基化程度也都極顯著升高（表3、表4）。6-BA組PLB活力指標僅分化率有變化，較對照顯著提高（表1）;總活性氧水平、總抗氧化能力分別顯著降低和顯著升高（表2、表3），對應3種活性氧（包括·OH相對含量）、MDA指標都顯著降低（表2），抗氧化酶POD活性極顯著提高（表3），DNA甲基化程度極顯著降低（表4）。

（3）在培養第24個月，對照組PLB增殖倍數和分化率與第16個月相比分別顯著降低和極顯著降低（表1），總活性氧水平和總抗氧化能力分別差異不顯著和極顯著降低（表2、表3），MDA含量、DNA甲基化程度都極顯著升高（表3、表4）。6-BA組PLB與對照相比，增殖倍數、分化率分別顯著降低和極顯著降低（表1）;總活性氧水平顯著提高（表2），總抗氧化能力極顯著降低（表3），·OH相對含量、H2O2含量和MDA含量分別極顯著或顯著升高（表2），POD和CAT活性顯著降低（表3），DNA甲基化程度、增色效應分別較對照顯著降低和極顯著降低（表4）。

從整個培養過程看，6-BA組PLB總活性氧水平在第8、16個月都較對照顯著降低，第24個月顯著提高，3個活性氧指標中僅·OH相對含量較對照在第8、16個月都降低，第24個月升高，即與總活性氧水平同向消長。總抗氧化能力方面，6-BA組PLB較對照在第8、16個月都升高，第24個月降低，3個抗氧化酶指標中僅POD活性變化在第8、16個月都升高，第24個月降低，即與總抗氧化能力同向消長。6-BA組的DNA甲基化程度始終較對照降低，增色效應到第24個月極顯著降低。

2.2 ?6-BA對長期繼代培養PLB玻璃化的效應

繼代培養第8、16個月均沒發現PLB有玻璃化現象，第24個月才發現有玻璃化現象。培養第24個月的PLB的玻璃化情況以及培養第24個月的正常PLB進行分化培養的玻璃化情況見表5，6-BA組的玻璃化瓶數的發生率和PLB玻璃化發生率都高于不含激素的對照組（僅1瓶玻璃化），6-BA組PLB的玻璃化情況如圖1C所示。取2組非玻璃化PLB在分化培養基繼續培養2個月，6-BA組的玻璃化瓶數的發生率（圖1D）和PLB玻璃化發生率都較對照組高。

3 ?討論

3.1 ?繼代培養期間6-BA對類原球莖衰老退化的效應

根據植物衰老的激素假說，一定濃度細胞分裂素能夠減輕組織細胞遭受的氧化脅迫水平，延緩植物衰老，如細胞分裂素能調節內源激素水平，減緩抗氧化酶活性和葉綠素含量的下降，降低自由基水平和丙二醛含量，提高脯氨酸含量水平[18-20]，在分子水平，采用基因工程轉入促進細胞分裂素合成的基因或轉入降解細胞分裂素的基因，研究細胞分裂素對衰老的影響，已有不少報道。過高濃度的細胞分裂素不但導致生理病害影響植物的正常生長和發育，還引起某些微繁殖植株的變異[21-23]，細胞分裂素誘發細胞變異機制報道較少，包括染色體變異[1]、轉座子活化[24]、DNA甲基化狀態改變[25-27]等。長期繼代培養物表現出的衰老退化，是生理與遺傳因素共同作用的結果。

在本研究中，培養第8個月（前期），對照組PLB較初代總活性氧水平顯著提高，總抗氧化能力、MDA含量沒有變化，推測PLB遭受氧化脅迫水平有所提高。6-BA組PLB總活性氧水平較對照顯著降低，總抗氧化能力顯著提高，有毒物質MDA含量沒有顯著變化，結果有利減輕氧化脅迫，6-BA組PLB的DNA甲基化程度較對照組顯著降低，上述指標變化并未導致6-BA組PLB的增值倍數和分化率發生改變。

培養第16個月（中期），對照組PLB分化率與第8個月相比顯著降低，總活性氧水平升高、總抗氧化能力降低和MDA含量升高，說明繼代16個月使PLB遭受較強氧化脅迫，DNA甲基化程度較初代和第8個月都顯著提高，一般認為DNA（主要是5-甲基胞嘧啶）甲基化程度提高關系形態發生能力喪失[28-29]。6-BA組PLB較對照的總活性氧水平、MDA含量顯著降低，總抗氧化水平顯著提升，即6-BA減輕了PLB遭受的氧化脅迫，抑制了生理衰老。DNA生化指標方面，一些研究表明DNA去甲基化可響應非生物或生物脅迫，常常起到激活特定群體基因表達的作用[30]，WUS基因是調控植物再生過程的4個主要基因之一[31]，Shemer等[27]報道培養基細胞分裂素使WUS基因啟動子去甲基化，可能是導致擬南芥獲得較高再生能力的因素。本研究中6-BA組PLB的DNA甲基化程度較對照極顯著降低，可能是對繼代16個月PLB所遭受氧化脅迫的反應，去甲基化一般有利基因活躍表達和分化[1，27，29]，可能導致6-BA組PLB分化率的提高。

培養第24個月（后期），對照組PLB的增值倍數、分化率都較第16個月降低，雖然總活性氧水平沒變化，但總抗氧化能力降低、MDA含量升高，表明PLB遭受較強氧化脅迫，DNA甲基化程度升高（其原因如前言所述，除了生長調節物質，培養物遺傳物質自發變異的積累、離體培養環境自身的非生物脅迫等也是影響長期繼代無性系各指標變化的重要因素），這些指標變化可能也與分化能力降低有關[28-29]。6-BA組PLB的增值倍數、分化率分別較對照顯著和極顯著降低，PLB總活性氧水平、MDA含量較對照分別顯著和極顯著提高，總抗氧化能力極顯著降低，表明隨著繼代培養，激素的作用日益累積，6-BA作用到培養后期強化了氧化脅迫，進一步促進PLB的生理衰老。DNA生化指標方面，6-BA組PLB甲基化程度顯著降低，可能并不支持PLB分化率降低的結果，增色效應是雙鏈DNA變性后，分開成單鏈DNA的重要性質，6-BA組PLB的DNA增色效應降低，說明DNA發生鏈間交聯，即DNA雙鏈之間出現共價鍵聯接[17，32]，它可妨礙DNA復制、轉錄等，出現變異細胞。已知活性氧自由基能引起DNA堿基修飾、DNA鏈斷裂以及染色質交聯，MDA會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，培養后期6-BA誘發PLB的總活性氧水平、MDA含量較對照有極顯著提高，對DNA鏈的攻擊可能導致DNA鏈遭受破壞。

筆者曾以無激素培養基（同本文對照組）為對照，添加抗氧化劑半胱氨酸和甘露醇為處理組繼代蝴蝶蘭PLB作了連續報道，處理組PLB增殖率、萌發率有所提高，培養期間處理組PLB總抗氧化能力均較對照組高[4]，總活性氧水平均較對照組低[5]，即24個月的整個繼代培養期間，處理組PLB遭受的氧化脅迫比對照低。本實驗6-BA（3.0?mg/L）組PLB氧化脅迫水平在第8、16個月都較對照組降低，第24個月較對照高，說明在培養前、中期，6-BA與半胱氨酸和甘露醇組合[4]起到類似的抗氧化作用，而在培養后期，6-BA效應則轉而增強氧化脅迫。此外，本實驗6-BA組PLB氧化脅迫水平在第8、16個月都較對照組降低，第24個月提高，期間伴隨·OH相對含量和POD活性分別相向和反向同步變化，·OH是所有活性氧種類中反應活性最高的，能與所有生物分子發生反應從而造成細胞損傷，是DNA氧化損傷的主要來源，POD酶活性變化直接或間接調控IAA的水平，被認為是分化的主要相關性酶[33-34]。細胞分裂素可誘導去甲基化[25，27]，本實驗6-BA使PLB的DNA甲基化程度在3個時間點都較對照低，上述報道[5]抗氧化劑處理組PLB的DNA甲基化程度在第8個月與對照差異不顯著，第16、24個月較對照低，即6-BA對DNA去甲基化的效應表現比抗氧化劑早。本研究處理組PLB的DNA增色效應到第24個月較對照降低，說明6-BA對PLB作用到第24個月才表現對DNA鏈的誘變效應。

3.2 ?類原球莖玻璃化誘導因素

培養第24個月，PLB出現玻璃化（超含水）現象。蘭科植物組培類原球莖、瓶苗普遍存在玻璃化現象，同其他植物一樣，6-BA或其他細胞分裂素濃度過高起到關鍵性作用，高濃度的細胞分裂素阻礙木質素和纖維素形成，不利于木質化和細胞壁的形成，壁壓降低促進被動吸水形成玻璃苗[35]。對于長期繼代蝴蝶蘭原球莖，同樣也是6-BA長期積累導致玻璃化[15，36]。張立全等[36]報道由于培養基長期使用6-BA，蝴蝶蘭原球莖內6-BA含量遠遠高于NAA，體內激素比例嚴重失調而導致玻璃化現象嚴重。本實驗中，在培養第24個月，6-BA組PLB玻璃化較對照組嚴重，說明6-BA長期積累促進了PLB玻璃化。

培養第24個月的非玻璃化PLB在相同配方的分化培養基中培養，6-BA組玻璃率化較對照組的高，說明6-BA組PLB對玻璃化敏感。玻璃化苗常伴隨氧化脅迫的發生及活性氧、MDA等的積累[37-39]，6-BA組PLB較對照經受較強氧化脅迫，該組PLB的·OH相對含量、H2O2和MDA含量都較對照高，POD和CAT活性降低，可能也與誘導玻璃化有關。DNA甲基化方面，玻璃化苗總基因組DNA甲基化高于或低于正常苗有不同報道[38，40]，本實驗6-BA組PLB的DNA甲基化程度較對照顯著降低。

細胞分裂素最明顯的生理作用，一是促進細胞分裂和調控其分化，二是延緩蛋白質和葉綠素的降解，延遲衰老。本實驗蝴蝶蘭類原球莖在6-BA培養基繼代培養24個月，前、中期6-BA主要表現減緩類原球莖衰老退化的效應，培養后期6-BA則加劇了這種衰老退化，并導致類原球莖玻璃化，所以在蝴蝶蘭類原球莖的繼代培養中，應注意調整細胞分裂素用量和控制繼代次數。通過培養條件（尤其是培養基激素）優化和繼代次數規范等，是高效獲得質量均一的大批量類原球莖、實現標準化生產的重要手段。本研究結果將為細胞分裂素在蘭科植物組培類原球莖的合理應用提供借鑒，也為進一步研究細胞分裂素對植物組織的生理生化、遺傳變異效應提供基礎。

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責任編輯：沈德發