一個鑒別低溫刺激型秀珍菇的ISSR-SCAR標記建立與應用

陳雪鳳 吳圣進 王燦琴 韋仕巖 王曉國 郞寧 張雯龍

摘 ?要：為了快速、準確地鑒別低溫刺激型秀珍菇菌株，在對18個供試菌株進行拮抗試驗、現蕾出菇試驗、ISSR圖譜分析的基礎上獲得了秀珍菇菌株的ISSR特異性標記，將其克隆、測序。根據測序結果，應用Primer 6.0軟件設計SCAR引物進行引物篩選，獲得1對引物并成功轉化為低溫刺激型秀珍菇的穩定SCAR標記。采用該引物對供試秀珍菇菌株的基因組DNA 進行PCR擴增，低溫刺激型秀珍菇菌株均能擴增出大小為205 bp的特異性DNA片段。該ISSR-SCAR標記能快速、有效地鑒別出低溫刺激型秀珍菇菌株，準確率達100%，為秀珍菇種質資源的鑒別和分類提供了技術支撐。

關鍵詞：秀珍菇;低溫刺激;ISSR特異性標記;SCAR分子標記

Abstract： A specific ISSR marker was obtained based on the antagonism test， fruiting test and ISSR spectrum analysis of 18 strains to identify the low-temperature stimulating type of Pleurotus geesteranus rapidly and accurately. The specific ISSR marker was cloned and sequenced. SCAR primers （designed by Primer 6.0） for the specific ISSR marker were screened， than a pair specific primers were obtained， which could convert the specific ISSR marker to stable SCAR mark. Verification was conducted by PCR using the screened specific primers to amplify the genomic DNA. Results showed that 205 bp specific fragment was amplified only in the low-temperature stimulating type of P. geesteranus strains. This ISSR-SCAR marker could distinguish the low-temperature stimulating type of P. geesteranus strains rapidly with accurasy of 100%. This study would provide a technological support for the identification and classification of P. geesteranus germplasm resources.

Keywords： Pleurotus geesteranus; low-temperature stimulating; specific ISSR marker; SCAR marker

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）隸屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、側耳科、側耳屬，商品名或俗稱鳳尾菇，其味道鮮美、營養豐富，是一種深受廣大消費者喜愛的食用菌。近年來隨市場的需求，秀珍菇的栽培規模日益增大，且國內栽培的秀菇菌株品種繁多。秀珍菇根據出菇溫度可分為高溫型品種和低溫型品種，根據出菇是否需要低溫刺激可分為自然出菇型（俗稱假秀珍）和低溫刺激型（也稱反季節秀珍菇或真秀珍）。自然出菇型秀珍菇特性是菌絲長滿袋且生理成熟后不需要低溫刺激即可出菇。低溫刺激型秀珍菇特性是菌絲長滿袋且生理成熟后，需要低溫刺激方能整齊出菇。真秀珍菇和假秀珍由于出菇時對低溫溫差要求程度不一樣，因而栽培管理方法差異較大。生產中如不了解秀珍菇出菇時所需要的溫度特性，采取不恰當的栽培管理方法，會造成出菇差或不出菇、產量低等問題。鑒別秀珍菇出菇是否需要低溫刺激，在菌絲生長階段無法判斷，只有在栽培出菇后才能判別。但栽培出菇周期長，耗時耗力，出菇時還會受到各種氣候因素的影響，判定結果會存在較大誤差。因此，迫切需要一種簡便快速的方法來鑒別不同溫型的秀珍菇品種。

DNA分子標記由于檢測手段簡單、高效，被應用到許多領域。近年來，利用分子標記進行食用菌品種種間的遺傳多樣性分析、遺傳育種、檢測和基因克隆等方面研究在很多品種上都有廣泛應用。分子標記種類很多，如RAPD、SSR、SRAP、ISSR等，其中SCAR標記（Sequence characterized amplified region）重復性好、可靠性高、對反應條件不敏感、不同材料的DNA差異可通過單一條帶的出現與否加以判斷，是一種非常方便、快捷的可用于快速檢測大量個體的方法。目前，在香菇、黑木耳、蘑菇、草菇、側耳、羊肚菌等種質資源上已建立了穩定的SCAR標記[1-8]。在秀珍菇研究上，已有ISSR[9-12]、SRAP[13]、RAPD[14-15]、EST-SSR[14]等分子標記應用于種質資源遺傳多樣性和親緣關系分析方面的報道，但能成功轉化成SCAR穩定標記的研究較少。有學者發現秀珍菇出菇溫型與ISSR分子標記分類相關性較高[11]，但沒有與溫度相關的SCAR分子標記的報道。

目前，我國秀珍菇品種繁多且各地相互引種，異種同名、同物異名現象較多，菌種混亂，為了更便捷、準確、科學地進行低溫刺激型與非低溫刺激型秀珍菇菌株的鑒定分類，本研究采用拮抗、出菇試驗、ISSR分子標記技術對18個秀珍菇菌株進行了測定，旨在構建可以鑒別低溫刺激型秀珍菇菌株的SCAR分子標記，為加快秀珍菇菌株的鑒別和定向選育提供分子技術支撐。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試菌株 ?供試菌株為18個秀珍菇菌株，具體名稱和來源見表1。

1.1.2 ?培養基 ?出菇試驗培養料配方：棉籽殼20%、桑枝30%、木屑30%、麥麩18%、輕鈣1%、石灰1%。PDA綜合培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂2 g、磷酸二鉀2 g、瓊脂20 g、水1000 mL。

1.1.3 ?試劑 ?基因組DNA提取試劑盒、2×Es TaqMasterMix （Dye）、Marker DL2000購自北京康為世紀生物有限公司;通用型DNA純化回收試劑盒購自北京天根生化科技公司;GeLRed核酸凝膠染料購自上海玉博生物科技有限公司;DNA連接試劑盒購自TaKaRa公司;ISSR、SCAR引物由北京擎科生物技術有限公司合成，引物的名稱及核苷酸序列見表2～表3。

1.2 ?方法

1.2.1 ?供試菌株出菇溫差類型的初步判定 ?18個秀珍菇菌棒菌絲長滿后，進行出菇試驗。出菇分2種方式進行：①菌棒菌絲生理成熟后在25～28?℃下自然放置進行出菇，4～6 d觀察現蕾出菇情況;②菌棒菌絲生理成熟后放入8～10?℃的冷庫中放置12?h后，拿出放置室溫下2～3?d，觀察菌棒現蕾出菇情況。

1.2.2 ?18個菌株的拮抗試驗 ?利用PDA綜合培養基對18個菌株進行拮抗試驗。接種后的培養皿放置于28?℃的培養箱中培養，培養10?d左右觀察菌株之間的拮抗反應[16]。

1.2.3 ?基因組DNA的提取與檢測 ?將菌絲塊接種到PDA綜合培養基的培養皿上，于27?℃培養6～8?d，用解剖刀刮取菌絲。使用DNA提取試劑盒提取菌絲DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測質量，質量合格的DNA儲藏于?20?℃冰箱備用。

1.2.4 ?具有多態性、特異性ISSR引物的篩選 ?利用前期研究[9]篩選獲得18個對秀珍菇具有多態性的ISSR引物（引物序列見表2）對供試的18個秀珍菇菌株基因組DNA進行擴增。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠檢測，觀察ISSR圖譜，選出具有特異性片段的ISSR引物。ISSR-PCR反應體系及條件：2×Es TaqMasterMix（Dye） 12 μL，ddH2O 11?μL，引物（10?μmol/L）1?μL，DNA模板1?μL，總體積25?μL;94?℃預變性5?min;94?℃變性30?s，45～55?℃退火30?s，72?℃延伸1?min，共35個循環;最后72?℃終延伸10?min，16?℃保存30?min。

1.2.5 ?秀珍菇特異性DNA片段的獲取及序列測定 ?從18個菌株中選出4個代表菌株（低溫刺激型菌株臺秀57（農）、金秀和非低溫刺激型菌株秀珍P54、農秀18），利用1.2.4篩選出的特異性引物分別對4個代表菌株的基因組DNA進行PCR擴增，并進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。紫外光下查看在瓊脂糖凝膠的特異條帶，利用通用型DNA純化回收試劑盒對特異片段進行DNA純化回收。將回收純化的DNA片段連接到載體pMD18-T Vector上，進行轉化培養，培養后對克隆菌落進行PCR擴增。然后用1.2%的瓊脂糖凝膠對ISSR-PCR產物、回收產物、克隆-PCR產物進行電泳檢測，對正確的克隆子進行測序。克隆子PCR擴增反應體系及條件：2×Es Taq Master Mix（Dye） 10?μL，M13（47）0.5?μL，M13（48）0.5?μL，克隆子稀釋液模板0.5??L，ddH2O 8.5?μL，總體積20?μL;94?℃預變性5?min;94?℃變性30?s，56?℃退火30?s，72?℃延伸90?s，25個循環;最后72?℃延伸5?min。

1.2.6 ?SCAR引物合成及SCAR標記的驗證 ?根據克隆子測序結果，用Primers 6.0設計SCAR引物，由北京擎科生物技術有限公司進行引物合成。利用合成引物對4個代表菌株基因組DNA擴增，進行引物篩選。利用篩選出來的合成引物對18個秀珍菇菌株基因組DNA擴增驗證，并對特異片段進行測序。SCAR擴增反應體系：DNA模板l?μL，2×Es Taq MasterMix（Dye）12?μL，前引物（10 μmol/L）1?μL，后引物（10 μmol/L）1?μL，ddH2O 10?μL，總體積為25?μL;94?℃預變性5?min;94?℃變性30?s，55～65?℃退火30?s，72?℃延伸l?min，35個循環;72?℃終延伸10?min。

2 ?結果與分析

2.1 ?菌株出菇類型的初步判定

通過18個菌株出菇試驗，臺秀57（農）、臺秀2號等8個菌株的菌絲長滿生理成熟后，在25～28?℃條件下，菌棒不會直接出菇，而在較大的低溫刺激（8～10?℃）條件下能很快現蕾出菇，且出菇整齊;秀珍12、秀珍990等10個菌株菌絲滿袋后在25～28?℃溫度條件下直接現蕾出菇，同時在低溫條件下刺激也能現蕾出菇，但出菇不整齊，具體情況見表4。

2.2 ?供試菌株的拮抗情況

拮抗試驗顯示，低溫刺激型秀珍菇菌株與非低溫刺激型菌株拮抗程度較大，同類菌株之間無拮抗或拮抗程度較低（表5、圖1～圖2）。

2.3 ?具有多態性、特異性ISSR引物的篩選

通過18個ISSR通用引物對18個供試菌株基因組DNA的PCR擴增產物圖譜發現（圖3），ISSR通用引物8對供試菌株具有多態性和特異性，即不同類型的菌株能擴增出較一致且有別于其他菌株的特異性譜帶。

2.4 ?秀珍菇特異性DNA片段的獲取及序列測定

利用ISSR通用引物8分別對4個菌株的基因組DNA進行PCR擴增，獲得特異性譜帶（圖4）。回收利用臺秀57的特異譜帶，通過ISSR-PCR產物、膠回收產物、克隆子-PCR產物電泳檢測，觀察檢測圖譜，3個產物擴增條帶位點一致（圖5），說明陽性克隆子克隆正確。選出正確的克隆子進行測序，所得臺秀57（農）膠回收DNA片段序列長1312 bp（圖6A）。

2.5 ?SCAR引物的篩選及驗證

根據臺秀57獲得的1312bp DNA序列共設計合成5對SCAR引物（表3）。利用這5對引物分別對4個代表菌株的基因組DNA進行PCR擴增。由圖7可見，低溫刺激型菌株臺秀57、金秀利用引物A能擴增出特異性片段，而利用其他SCAR引物擴增，沒有獲得特異性片段。利用引物A對18個供試菌株的基因組DNA進行擴增，由圖8可見，8個低溫刺激型菌株均能擴增出特異性片段，而10個非低溫刺激型菌株未能擴增出特異片段。通過驗證，可以說明引物A是低溫刺激型秀珍菇的特異性標記，鑒定準確率達100%。特異性片段經膠回收測序，片段大小為205 bp（圖6B）。

3 ?討論

用于真菌菌種鑒定的拮抗反應是指同種真菌不同個體之間的一種相互識別、相互排斥的現象，準確的應該叫做體細胞不親和性或營養不親和性。長期以來，拮抗反應被廣泛用于真菌菌株鑒別、群體遺傳學研究中，但是，由于非拮抗基因

的差異也造成了親和菌株間的遺傳差異，拮抗反應程度如弱，拮抗與無拮抗之間的界定受實驗者主觀影響比較大，培養基成分也影響拮抗的有無和程度強弱。拮抗反應鑒別親和菌株的遺傳關系存在著不確定性，對于遺傳關系比較近的菌株來說，拮抗反應只能作為菌種鑒定的一個輔助方法[17-18]。出菇試驗是種質資源鑒定評價所必須的，但在區別溫差型品種時，受外界自然條件影響較大，如在秋冬或冬春栽培時，有時外界環境早晚溫差大，全部菌株均會正常出菇，導致錯誤判斷某些菌株是低溫刺激型或是非低溫型菌株。DNA是物種中較穩定的遺傳物質，其反映遺傳關系較形態學和生理生化指標更客觀準確，SCAR分子標記技術操作簡單、快速、準確可靠，不受外界環境條件的影響，是較為可靠的秀珍菇種源鑒定分析的方法，但有時因DNA酶降解等一些因素，偶爾會產生一些不穩定性。因此，在種質資源鑒定中，三種方法結合使用則更為科學、準確。

ISSR檢測手段簡單、高效，常用于揭示食用菌遺傳多態性和區分種內菌株間親緣關系，是一種快速、可靠的工具。馮偉林等[11]、陸娜等[10]、林原等[12]、熊芳[7]利用ISSR技術對秀珍菇菌株進行了種群分類，即種內菌株間的親緣性鑒定。在幾位學者的研究中，大部分只是將他們所研究的菌株分為幾個類群，只有馮偉林等[11]發現農藝性狀中出菇溫度與ISSR分子標記有相關性，但沒有找到與溫度相關的準確分子標記報道。熊芳[7]利用RAPD、SRAP、ISSR分子技術進行了秀珍菇種質資源種群分析，并建立6個SCAR標記，但這幾個分子標記未說明與溫型相關。筆者在前期研究中，利用ISSR技術對8個秀珍菇菌株多樣性研究分析[9]，發現在遺傳相似系數0.59時8個菌株明顯分為2個群，即不需要大溫差刺激出菇的菌株類群與需要大溫差刺激出菇的菌株類群，2個類群親緣關系較遠，這也進一步說明了出菇溫型與ISSR分子標記分類相關性較高。但ISSR擴增易受反應條件影響，結果存在重復性差的問題，而且由于圖譜條帶數多、背景模糊，給判斷會帶來一定的誤差。與ISSR標記相比，SCAR分子標記對反應條件不敏感，容易獲得穩定的、可靠的、可重復的條帶，因此，筆者在ISSR分析的基礎上，將ISSR標記成功轉化成SCAR標記，提高了鑒定的穩定性、準確性。

本次研究的供試菌株選擇了近幾年在廣西范圍內推廣應用的菌株，驗證效果明顯，但國內當前栽培的秀珍菇菌株眾多，且各地交叉引種頻繁，異種同名、同物異名現象較多，本研究構建的SCAR標記是否能廣泛應用于所有的秀珍菇菌株鑒定，尚有待于在更多樣品中進行檢驗。

參考文獻

張美彥， 尚曉冬， 譚 ?琦， 等. 香菇135菌株特異SCAR標記的分布和遺傳特性[J]. 食用菌學報， 2008， 15（4）： 1-5.

馬慶芳， 張丕奇， 戴肖東， 等. 黑木耳Au185菌株一個SCAR標記的建立[J]. 菌物研究， 2009， 7（2）： 104-108， 115.

李媛媛， 隋玉龍， 牛淑力， 等. SCAR標記在黑木耳栽培菌株分類鑒定中的應用[J]. 菌物研究， 2013， 11（3）： 182-185， 189.

史靈燕， 張云龍， 劉保衛， 等. 基于SRAP分子標記的24個黑木耳栽培菌株遺傳分析[J]. 食用菌， 2019， 41（6）： 20-23， 33.

張 ?靜， 陳文炳， 邵碧英， 等. 雙孢蘑菇SCAR標記的建立及在菌株群鑒定中的應用[J]. 中國食品學報， 2011， 11（4）： 194-202.

傅俊生， 劉新銳， 謝寶貴， 等. 草菇SCAR遺傳標記建立及其雜種鑒定應用[J]. 中國農學通報， 2010， 26（17）： 41- 46.

熊 ?芳. 分子標記鑒別側耳屬10種食用菌種植資源的研究[D]. 福州： 福建農林大學， 2008.

劉 ?偉， 蘭阿峰， 張倩倩， 等. 羊肚菌栽培菌株遺傳多樣性分析及種特異性RAPD-SCAR標記開發[J]. 菌物學報， 2018， 37（12）： 1650-1660.

陳雪鳳， 郎 ?寧， 韋仕巖， 等. 8個反季節秀珍菇菌株栽培性狀評價與遺傳差異分析[J]. 西南農業學報， 2019， 32（8）： 1898-1903.

陸 ?娜， 王偉科， 宋吉玲， 等. 秀珍菇種質遺傳多樣性分析與優質菌株篩選[J]. 中國食用菌， 2018， 37（6）： 20-23.

馮偉林， 蔡為明， 金群力， 等. 秀珍菇菌株主要農藝性狀比較及ISSR分子標記鑒定[J]. 食用菌學報， 2014， 21（2）： 14-18.

林 ?原， 陳 ?劍， 趙光輝， 等. 7個秀珍菇菌株栽培特性及ISS R遺傳分析[J]. 福建農業學報， 2015， 30（4）： 339- 343.

盧政輝. 秀珍菇及其近緣22株菌株的SRAP分析[J]. 江西農業學報， 2008， 20（11）： 8-10， 13.

忻 ?雅， 阮松林， 王世恒， 等. 基于RAPD和EST-SSR標記的秀珍菇菌株聚類分析[J]. 食用菌學報， 2008， 15（4）： 20-25.

朱 ?堅， 盧啟泉， 謝寶貴. 秀珍菇種質資源分子多態性研究[J]. 菌物學報， 2007， 26（增刊）： 226-231.

陳雪鳳， 韋仕巖， 吳圣進， 等. 廣西野生靈芝菌株的遺傳多樣性分析[J]. 北方園藝， 2016（7）： 136-139.

張金霞. 中國食用菌菌種學[M]. 北京： 中國農業出版社， 2011： 76-81.

張美彥. 香菇135菌株特異SCAR標記的遺傳規律[D]. 南京： 南京農業大學， 2007.

責任編輯：黃東杰