低氮脅迫對不同耐瘠性苦蕎土壤氮轉化酶活性的影響

王 佳, 陳 偉, 張 強, 王紅陽, 李亞新

(1.山西師范大學 地理科學學院, 山西 臨汾 041004; 2.山西師范大學 生命科學學院, 山西 臨汾041004; 3.山西省資源環境信息化管理院士工作站, 山西 臨汾 041004)

“缺氮、少磷、鉀充足”是黃土高原瘠薄地區土壤養分含量的共同特點。苦蕎因生育期短和耐瘠性好被廣泛種植在黃土高原生態環境較嚴酷的地區，也是中西部經濟相對落后地區的主要糧食作物、經濟作物和避災救荒作物，有著其他大宗作物無法替代的區位優勢[1]。有些地區沒有苦蕎的種植，就“人無糧、畜無草、家無錢”，苦蕎在構建中西部糧食安全和貧困地區社會發展中起著不可或缺的作用。苦蕎還具有醫食同源的獨特營養價值，隨著人們健康意識的提升與苦蕎功能性價值的推廣，近年來關于苦蕎的研究大部分集中在地上部分植株的養分價值[1-3]、品種選育[4-6]和逆境脅迫對苦蕎化學成分及生理機能的影響[7-8]的研究，對于不同耐瘠性苦蕎對土壤低氮脅迫的響應機制鮮有報道。

面對低氮脅迫時，根系分泌物的成分和數量會發生急劇變化來適應環境[9]，并且作物品種間對養分的吸收存在差異性。張楚等[10]在試驗中研究了苦蕎基因型耐性與敏感性之間的相互作用，發現低氮脅迫下耐低氮苦蕎根部可溶性糖和游離脯氨酸含量增加，苦蕎葉片的最大熒光產量(Fm)和效率(Fv/Fm)顯著降低，耐低氮品種根吸收活力更高，抗氧化能力的降低幅度更大，根冠比降低也明顯。苦蕎遭遇養分脅迫時，根系也可以通過增加有機酸的分泌量改變根際微環境來增強養分的吸收[11]，但是土壤中氮源的供給數量和差異對苦蕎根系分泌物量和種類卻有不同的影響[12]。在農業生態系統中土壤酶來源于植物和微生物，是氮轉化過程的關鍵因子[13-14]，它們直接參與營養礦化和有機物分解并且控制土壤中氮素供給的數量和形態。有研究發現，低氮脅迫下，迪慶苦蕎根際土壤的草酸和酒石酸的含量高于黑豐1號[15]，苦蕎可以通過根際土壤纖維素酶活性[16]，β-葡萄糖苷酶，蔗糖酶的活性升高來調節根際土壤中養分有效性來增加抵抗環境逆境的風險[17]，耐低氮品種的苦蕎根際土壤酶在低氮脅迫的環境下更傾向于消耗結構簡單的碳源，而氮敏感的品種傾向于利用結構復雜的碳源[18]。

為此，本文以迪慶苦蕎和黑豐1號兩種不同耐氮性苦蕎為試驗對象，通過盆栽試驗，研究低氮脅迫下苦蕎氮轉化酶對土壤中氮素形態和含量的調節，探究不同耐瘠性苦蕎品種在低氮脅迫下的響應機制，以期為黃土高原等土地養分貧瘠地區苦蕎氮肥的優化管理提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗設計

試驗地位于山西省臨汾市山西師范大學塑料大棚內，其種植前的土壤采自山西省鄉寧縣水土保持監測站長期撂荒地0—20 cm土層，為黃土母質上發育的褐土，供試土壤理化性狀見表1。將土壤過2 mm篩，丟棄土壤中的土塊和石頭，并在種植盆栽前充分均質化，每盆中裝10 kg土壤，種植兩種不同苦蕎品種：迪慶苦蕎(DQ，耐低氮品種)和黑豐1號(HF，不耐低氮品種)，苦蕎的種子分別由迪慶藏族自治州農業科學研究所和山西省農業科學院高寒作物研究所提供[16]。試驗設置3個處理：(1) 對照(以下簡稱CK，不施氮肥)；(2) 低氮量(以下簡稱N1，尿素80 mg/kg)；(3) 正常施氮量(以下稱為N2，尿素160 mg/kg)，每個處理重復三次。每種處理都使用相同的磷酸鹽肥料(P2O5，150 mg/kg)和鉀肥(K2O，60 mg/kg)作為基礎肥料，同時，在每個盆中選擇12粒種子，在去離子水中浸泡24 h，均勻播種，最終定植為每盆8株植物，每盆每天澆400 ml水。在苦蕎生長到成熟時期(8月31日)采用“抖土法”收集土壤根際樣品，同時收集苦蕎的籽粒。

表1 供試土壤基本理化性質

1.2 測定指標及方法

土壤含水量采用105℃烘干法測定，pH用水土比(2.5∶1)浸提 pH計測定，有效磷用0.52 mol/L NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法；有機碳用重鉻酸鉀加熱法測定；速效鉀用1 mol/L中性醋酸銨浸提—火焰光度法測定；全鉀的測定采用高氯酸硫酸消煮—火焰光度計法；全氮的測定用凱氏定氮儀法；全磷的測定用高氯酸硫酸消煮—分光光度計法；土壤銨態氮、硝態氮在25℃條件下用2 mol/L氯化鉀浸提后用全自動間斷化學分析儀(SmartChem140)測定[19]。苦蕎的成熟期收集籽粒，并帶回實驗室記錄結實數，在105℃殺青30 min后65℃烘干之恒重并稱干重，用以計算千粒重。

土壤銨氧化酶：以硫酸銨作底物，土壤樣品在25℃下培養5 h，培養期間釋放的亞硝態氮的用氯化鉀提取，并在520 nm下比色測定[20]；土壤蛋白酶：用酪蛋白作為底物，土樣在50℃、pH8.1條件下培養2 h，浸提出培養過程中釋放的氨基酸，剩余的底物用三氯乙酸沉淀。芳香族氨基酸與FolinCiocalteu`s酚試劑在堿溶液中反應形成藍色化合物，在700 nm比色下測定[21]。

1.3 數據處理

采用 Excel 2010軟件進行數據處理，用Origin 8軟件畫圖，利用SPSS 21.0統計軟件對數據進行單因素方差分析、裂區分析、以及獨立樣本T檢驗進行差異顯著性檢驗；CANOCO 4.5軟件進行酶活性與環境因素間的RDA分析，其中對坐標軸采用蒙特卡羅置換檢驗，得出對酶作用的環境因子的排序。

2 結果與分析

2.1 不同施氮量及品種對土壤理化性質的影響

注：SOC：有機碳(g/kg)；C/N：碳氮比；TN:全氮(g/kg);TP:全磷(g/kg);TK:全鉀(g/kg);AP:速效磷(g/kg);AK:速效鉀銨態氮硝態氮(mg/kg)其上大寫字母表示同一品種的不同氮處理在(p<0.05)概率水平差異顯著，小寫字母表示同一氮處理在不同品種在(p<0.05)概率水平差異顯著，下同。

2.2 不同施氮量及品種對氮轉化相關酶活性的影響

裂區分析顯示，品種、施氮量以及品種和氮處理的交互作用對銨氧化酶產生了極顯著的影響(p<0.01)。圖2A的結果表明，HF的銨氧化酶活性在CK處理下分別較N1，N2處理高107.22%和78.18%，同時DQ亦在CK處理下分別較N1，N2處理高97.53%和11.90%，HF和DQ的銨氧化酶活性均在N1處理下最低。在N1處理下，HF的銨氧化酶活性較DQ高37.61%。而在N2處理下，兩個品種沒有明顯的差異。

品種和氮處理對土壤蛋白酶活性有極顯著的影響(p<0.01)，但是品種和氮處理之間的交互作用并沒有對蛋白酶產生影響。HF的蛋白酶含量在N2處理下分別比CK，N1高46.52%，24.58%，DQ則在N1，N2處理下分別比CK高153.95%，186.70%；不同施氮量下，HF的蛋白酶活性均比DQ高253.27%，63.61%和80.54%(圖2B)。

圖2 不同氮處理和品種對氮轉化相關酶活性的影響

2.3 土壤理化性質與氮轉化相關酶活性的關系

3 討論與結論

氮素是植物生長的必需元素也是影響作物產量的關鍵因素，而土壤氮素轉化的過程是在植物、土壤酶以及土壤非生物條件相互作用下驅動的[22]。

注: TN：全氮；SOC：有機碳；TP：全磷；TK：全鉀；AP：速效磷；AK：速效鉀；銨態氮；硝態氮；pH：土壤酸堿度。

低氮脅迫還可以通過改變土壤的化學性質間接影響土壤酶的活性。我們發現低氮顯著影響土壤的C/N，pH和SOC，間接影響土壤酶活性，特別是在耐低氮的苦蕎中，C/N與銨氧化酶活性之間呈正相關，Geisseler和Horwath的研究表明[31]，C/N維持在10左右時，會導致胞外纖維素酶增加。Wang等[32]研究發現，土壤C/N低于10時，會在土壤微生物中形成氮限制。土壤pH也是影響酶活性的主要驅動力。本團隊以發表的研究結果得出，低氮條件下，苦蕎品種中有機酸的含量有所不同，例如耐氮性苦蕎中的草酸和酒石酸含量高于敏感性苦蕎品種[15]。根系分泌物和有機酸引起的這種差異可能會影響植物和養分獲取的分子信號[33-34]。最近的一項研究表明，土壤顆粒中的表面酸度而不是整體pH值控制著土壤中氮的吸收[35]。因此，低氮脅迫改變了根系分泌物的質量和數量，而且這種改變都有可能改變微生物碳的利用效率[36]。植物需要采取策略來避免氮限制，并在其生命周期內優化氮的使用。有研究表明植物根系直接暴露于稀缺或營養過剩的狀態，還可以響應氮缺乏的環境而調節基因表達來調節氮的吸收[37]。我們的RDA結果表明，品種是土壤中氮轉化過程關鍵酶活性最重要的影響因子。而在耐氮品種中，低氮脅迫對土壤酶的影響更大，許多研究人員發現，在植物地上癥狀的表現沒有地下過程敏感，因為植物對環境的反應受到養分有效性的影響并且會采取策略來避免氮限制[38]。Pivato等[39]研究表明，在農田生態系統中，低氮脅迫下，某些種間植物混合物的根際微生物豐富度顯著不同，而在正常氮量下，這種差異消失了。先前的研究還表明，在耐氮和對氮敏感的苦蕎品種之間，酶活性和有機酸發生了顯著變化[15-17]。張楚等[10,40]研究表明耐低氮品種苦蕎的葉綠素含量，最大熒光效率(Fv/Fm)和可溶性蛋白質的降低幅度均比低氮敏感品種小。我們的發現還表明，農作物品種對于確定酶對低氮脅迫的響應非常重要。植物物種對氮轉化關鍵過程的響應反過來又可以反饋給植物群落[41]。因此，我們發現迪慶苦蕎可以通過對土壤中酶的調節來對低氮條件下的資源進行有效的利用，增加氮的可用量來保證獲得更大的產量。

低氮的環境下會影響地下過程及養分轉化。苦蕎品種在低氮脅迫下對氮轉化關鍵過程的影響起著重要作用。與氮敏感的苦蕎相比，耐氮苦蕎中土壤酶對低氮響應更為敏感，這可能反過來影響農業生態系統中的分解過程和養分循環，進而影響氮的有效性以及苦蕎的產量。

總之，在苦蕎的成熟期，迪慶苦蕎對根際土壤的水肥的保持度及產量高于黑豐，而迪慶苦蕎氮轉化相關酶活性均比黑豐一號低，可能是迪慶苦蕎通過對土壤中的銨態氮和硝態氮的選擇性的吸收來改變根際土壤中的pH值從而調節環境中氮素的供給，并且冗余分析表明品種和水分對土壤氮轉化酶活性影響最大。因此，建議黃土高原土地養分貧瘠地區選用耐瘠性強苦蕎品種來增加收益。

致謝：非常感謝迪慶藏族自治州農業科學研究所與山西省農業科學院高寒作物研究所對本課題提供的種子資源。