葡萄籽多酚對免疫抑制小鼠腸道菌群的影響

王 偉，布麗根·加冷別克，祖麗普努爾·麥提賽伊迪，娜迪熱·阿卜杜克熱木，游義琳，胡曉東

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

人體腸道（腸黏液、腸腔、糞便）中棲居著眾多的腸道微生物，總數可達1013～1014個，在腸道中形成一個復雜互作的菌群生態系統。腸道菌群編碼的基因可達人體自身基因的100倍左右[1]，在腸道菌群結構穩定及腸道微生態平衡的狀態下，腸道菌群及其代謝產物對于機體物質能量代謝、提高機體免疫力、協助機體抗感染等生理調節作用的發揮具有十分重要的意義[2]。植物多酚是一類多羥基化合物，是廣泛存在于茶葉、葡萄、蘋果、酒類及多種水果和蔬菜中的具有多元酚結構的次生代謝物[3]。研究發現，植物多酚不僅具有抗氧化、抗腫瘤及免疫調節等生物活性[4]，還能調節宿主腸道菌群結構，調控腸道菌群的代謝通路，刺激乙酸、丙酸及丁酸等短鏈脂肪酸（SCFAs）的產生[5]，這些SCFAs可以被腸道黏膜吸收，給予結腸腸壁細胞能源，對腸道健康起重要作用，同時還可以降低腸道pH，抑制一些致病菌的生長[6]。

我國葡萄種植面積廣、產量高，據統計，約80%的葡萄被用來釀酒[7]。葡萄酒在加工過程中，一般會產生20%～25%左右的葡萄籽等廢棄物[8]，但其綜合利用水平仍有待提高。葡萄籽多酚是葡萄籽等廢棄物中的主要功能性成分之一，被認為是一種天然的強效抗氧化劑[9]。此外，大量動物試驗表明葡萄籽多酚可以調節腸道活動，改變腸道菌群的結構和功能，例如：Collins等[10]發現葡萄籽多酚不僅可以增加肥胖小鼠的胰島素抗性，還能提升腸道中毛螺菌屬（Lachnospiraceae）的豐度；Choy等[11]研究發現，葡萄籽多酚能夠增加雌豬腸道中毛螺菌屬（Lachnospiraceae）、梭菌屬（Clostridiales）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和瘤胃菌科（Ruminococcaceae）的豐度。鑒于目前國內外研究主要集中在葡萄籽多酚的抗氧化功效上，而有關葡萄籽多酚的免疫調節活性及其對免疫抑制小鼠腸道菌群的影響尚未進行充分的研究。因此，本研究采用環磷酰胺（Cyclophosphamide，CPA）誘導建立小鼠免疫抑制模型，通過Illumina MiSeq高通量測序平臺對小鼠糞便樣本中細菌16SrDNA V3-V4區進行分析，解析免疫抑制小鼠腸道菌群的變化，以期為葡萄籽多酚在預防、治療、提高機體免疫力及臨床應用等多方面提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

脫脂赤霞珠葡萄籽粉，由新疆天裕葡萄酒業有限公司贈送；清潔級BALB/c小鼠，雌性，質量18～22 g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供（合格證號0030557）。

免疫球蛋白試劑盒：南京建成生物工程研究所；糞便基因組DNA提取試劑盒：美國Omega Bio-Tek公司；瓊脂糖，福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸標準品：美國Sigma公司；環磷酰胺：美國Sigma-Aldrich公司；SCFAs標準品（乙酸、丙酸及丁酸）：北京中科質檢生物有限公司。

1.1.2 儀器與設備

79-3型恒溫磁力攪拌器：上海司樂儀器廠；XP2001S精密天平：梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2D雙人凈化工作臺：上海蘇凈實業有限公司；GRP-9160型隔水式恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；UV-5200型紫外可見分光光度計：上海美普達儀器有限公司；OSB-2100型真空旋轉蒸發儀：日本EYELA公司；Centrufuge5415R型高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；FE-20型pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；MiSeq測序儀：美國Illumina公司。

1.2 方法

1.2.1 葡萄籽多酚的制備

參照仇菊等[12]的方法，稱取1.0 g脫脂葡萄籽粉樣品，加60%乙醇20 mL，避光置于80℃水浴中提取2 h，6 000 r/min離心10 min取上清液，40℃旋蒸濃縮至原體積1/6后，置于-40℃真空凍干48 h得到葡萄籽多酚提取物。

1.2.2 葡萄籽多酚含量的測定

參考Chu等[13]的方法，準確稱取0.01 g葡萄籽多酚提取物，用0.4 mL的60%乙醇溶解，加入0.4 mol/L的福林酚試劑0.1 mL，混合均勻，30℃避光反應5 min后加入7%的碳酸鈉溶液1 mL，再用蒸餾水定容至2.5 mL，避光反應60 min后，用紫外可見分光光度計在747 nm處測定吸光值。

同時以沒食子酸為標準品繪制標準曲線（標準沒食子酸濃度為0.01～0.1 mg/mL），以吸光值為縱坐標，以標準沒食子酸溶液濃度為橫坐標，得到回歸方程：y=0.096 8x-0.013 4，R2=0.998 5。葡萄籽多酚提取物中總酚含量用沒食子酸當量（Gallic acid equivalent，GAE）μg GAE/mg DW表示。

1.2.3 動物分組處理

參照孔妮等[14]的方法，將40只清潔級BALB/c小鼠適應性飼養2 d后，隨機分為4組，每組10只，分別作為空白對照組，模型對照組、葡萄籽多酚提取物（多酚含量為40μg GAE/mg DW）低劑量組及高劑量組。除空白對照組外，其余各組連續3 d腹腔注射CPA（80 mg/（kg·d）），建立免疫缺陷小鼠模型；隨后，葡萄籽多酚提取物給藥組每天灌胃給藥，根據前期預試驗的結果，確定葡萄籽多酚提取物低、高劑量組的給藥量分別為50、150 mg/（kg·d），灌胃量均為0.3 mL/只，空白對照組和模型對照組每天灌胃等體積的生理鹽水，連續14 d。

1.2.4 免疫器官指數的測定

參照甘霓等[15]的方法，不同處理組的BALB/c小鼠末次灌胃給藥12 h后，采用乙醚麻醉后頸椎脫臼法處死，取脾臟及胸腺，計算臟器指數，臟器指數（mg/g）=臟器質量（mg）/體重（g）。

1.2.5 免疫球蛋白含量分析

參照孔妮等[14]和文艷巧等[16]的方法，于試驗結束時，小鼠摘眼球采血，收集血液于Eppendorf管中室溫靜置4 h后，置于4℃冰箱過夜，4 000 r/min離心15 min收集血清，采用ELISA法按照試劑盒說明書進行IgG、IgM的檢測；同時從距盲腸3 cm處剪取結腸1.5 cm，平鋪于濾紙上，縱向切開，暴露黏膜面，刮取腸黏液，收集于Eppendorf管中，再加入含0.1%蛋白酶抑制劑的0.01 mol/L冰浴磷酸鹽緩沖液1 mL，充分混勻，3 000 r/min離心15 min取上清液，采用ELISA法按照試劑盒說明進行sIgA檢測。

1.2.6 小鼠糞便的收集

小鼠灌胃給藥試驗結束后，無菌稱取小鼠結腸末端成形新鮮糞便0.3 g左右迅速置于-80℃超低溫冰箱，待分析用。

1.2.7 小鼠糞便DNA的提取

小鼠糞便DNA利用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.8 小鼠腸道微生物16SrDNA高通量測序

參照文獻[17-18]，利用Illumina MiSeq高通量測序平臺對提取的小鼠糞便微生物DNA進行高通量測序。采用細菌16SrDNA V3-V4擴增通用引物，測序引物為338F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’），不同樣本在引物5’端加入6 bp條碼序列用于區分樣品。

1.2.9 高通量測序數據分析處理

MiSeq測序數據使用TrimGalore、FLASH2及Mothur軟件進行質控拼接并去除低質量堿基[19-20]，利用USearch軟件得到質量和可信度較高的優化序列，該數據用于后續生物信息分析。運算分類單位（Operationaltaxonomicunit，OTU）聚類分析通過在QIIME中調用Uclust方法對優質序列按相似度0.97進行聚類[21]，選取每個類最長的序列為代表序列。OTU注釋通過在QIIME中采用BLAST的方法對序列數據庫進行比對[22]，獲得每個OTU分類學信息，利用R軟件生成樣本間（或組間）OTU的維恩圖。根據OTU列表中的各樣品物種豐度情況，應用Mothur軟件計算生物多樣性指數，并將優勢菌門（屬）與短鏈脂肪酸（SCFAs）結合制成冗余分析圖。

1.2.10 盲腸內容物SCFAs含量的測定

參照Alfa等[23]的方法，盲腸內容物稱重后溶于1 mL去離子水中，充分振蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清，經0.22μm水相濾膜過濾，用于氣相色譜檢測。檢測條件：SH-Rtx-5柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），載氣氮氣，總流速140 mL/min，進樣口溫度280℃，FID檢測器300℃，不分流；采用程序升溫：初始溫度80℃，以3℃/min升溫至150℃，然后以20℃/min升溫至250℃保持2 min；進樣量1μL。

1.2.11 數據處理

所有數據均以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 20.0統計軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey檢驗進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄籽多酚對小鼠免疫器官指數的影響

胸腺和脾臟是機體主要的免疫器官，免疫器官指數的改變是評價機體免疫能力狀況的關鍵指標[24]。葡萄籽多酚對小鼠免疫器官指數的影響如表1所示。

表1 葡萄籽多酚對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響Table1 Effects of grapeseed polyphenol on immune organs indexes of immunosuppressed mice 單位：mg/g

由表1可知：模型對照組小鼠胸腺指數和脾臟指數均顯著低于空白對照組（P＜0.05），說明小鼠免疫抑制模型造模成功；與模型對照組相比，葡萄籽多酚對BALB/c小鼠進行干預后，小鼠的胸腺指數、脾臟指數均顯著增加（P＜0.05），說明葡萄籽多酚可以在一定程度上保護小鼠的免疫器官，增強小鼠的免疫活性。

2.2 葡萄籽多酚對小鼠免疫球蛋白的影響

免疫球蛋白是免疫系統的有機組成部分，在體液免疫中發揮著重要作用。IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白，IgA是血清中含量僅次于IgG的免疫球蛋白，對機體局部黏膜免疫起到非常重要的作用，特別是對經黏膜途徑感染的病原微生物具有抵抗作用[25]，sIgA是消化道黏膜免疫最顯著的效應分子，可在腸黏膜表面形成有效的防御屏障[26]。葡萄籽多酚對小鼠免疫球蛋白的影響如表2所示。

表2 葡萄籽多酚對免疫抑制小鼠免疫球蛋白的影響Table 2 Effects of grape seed polyphenol on immunoglobulin of immunosuppressed mice 單位：μg/mL

由表2可知：與空白對照組相比，模型對照組小鼠免疫球蛋白含量（sIgA、IgM、IgG）顯著降低（P＜0.05），說明模型對照組小鼠體內特異性抗體分泌較少，免疫功能受到限制；與模型對照組相比，葡萄籽多酚干預能夠增加小鼠免疫球蛋白含量（P＜0.05），與De Leblanc等[27]的研究結果一致，推測葡萄籽多酚能夠刺激機體產生更多抗體，引起小鼠機體的特異性體液免疫應答，激發特異性抗體的大量產生，從而增強小鼠的免疫功能。

2.3 腸道菌群Alpha多樣性分析

α多樣性反映的是樣品菌群豐度及菌群多樣性，有多種衡量指標[28]。Chao1和ACE指數用來估計菌群豐度即菌群數量的多少，Shannon和Simpson指數用來估計樣本中菌群的多樣性，Coverage指各樣本文庫的覆蓋率[29]。由圖1可知，與模型對照組相比，低劑量葡萄籽多酚提取物樣品組中腸道菌群的數量最多（Chaol值469.09、ACE值459.45、Shannon值3.99、Simpson值0.04、Coverage值0.999 7）。這種現象可能是由于高劑量葡萄籽多酚提取物樣品組中的黃烷醇單體含量高于低劑量葡萄籽多酚提取物樣品組，而黃烷醇單體能夠與肽聚糖結合，破壞微生物細胞膜結構，具有抑菌作用[30-31]。

圖1 小鼠腸道菌群的OTU數量及Alpha多樣性Fig.1 OTUnumber and Alpha diversity of gut microbiota in mice

2.4 腸道菌群Beta多樣性分析

不同分組間的樣本存在一定的特性和共性，Venn圖[32]可以篩選每組樣本中特有的OTU以及組間共有的OTU。不同樣品組中群落Venn圖見圖2。

圖2 不同小鼠腸道菌群Venn圖Fig.2 Venn diagram of intestinal florain different mice

由圖2可知：空白對照組小鼠腸道菌群共得到499個OTU，模型對照組中腸道菌群共得到432個OTU，樣品低劑量組共得到561個OUT，樣品高劑量組中腸道菌群共得到457個OUT；其中空白對照組中特有腸道菌群的OTU為11個，模型對照組中特有腸道菌群的OTU為3個，樣品低劑量組中特有腸道菌群的OTU為72個，樣品高劑量組中特有腸道菌群的OTU為5個。由OTU數目分布Venn圖可以進一步得出，葡萄籽多酚低劑量組微生物豐度最高，對于小鼠腸道菌群具有調節作用。

2.5 菌群構成分析

不同樣品對小鼠腸道菌群構成的影響如圖3A和圖3B所示。

圖3 門水平（A）及屬水平（B）的小鼠腸道菌群相對豐度柱狀圖Fig.3 Relativeabundance of phylum(A)and genus(B)levels of gut microbiota in mice

由圖3A可知：在門水平，除去未確定類群的腸道菌，主要由厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍藻門（Cyanobacteria/Chloroplast）、軟壁菌門（Tenericutes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）及浮霉菌門（Planctomycetes）組成；其中變形菌門主要包含沙門氏菌（Salmonella）等致病菌[33]，與模型對照組相比，葡萄籽多酚提取物低劑量樣品組中變形菌門相對豐度最低，約為模型對照組數量的8.14%，表明葡萄籽多酚提取物在小鼠腸道菌群的作用下產生的代謝產物抑制了變形菌門的生長繁殖；同時對各組樣品中厚壁菌門與擬桿菌門的相對豐度進行分析發現，葡萄籽多酚低劑量組小鼠腸道中F/B值（F：厚壁菌門豐度值；B：擬桿菌門豐度值）較模型對照組顯著增加（P＜0.05），F/B值由1.34增加到3.13，這與訾雨歌等[34]的研究結果相似，表明低劑量葡萄籽多酚干預可以顯著調整腸道菌群的結構組成。

腸道菌群微生態失衡會引起人體出現免疫性疾病、代謝性疾病和消化性疾病[35]。植物多酚對維持腸道微環境的穩態有較大作用[36]。研究表明，植物多酚類物質可以抑制腸道內有害菌群的生長繁殖，促進有益菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌等的生長[37]。由圖3B可知：與模型對照組相比，葡萄籽多酚提取物干預顯著降低了巴恩斯氏菌屬（Barnesiella）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella）、艾克曼菌屬（Akkermansia）的相對豐度，且葡萄籽多酚提取物低劑量組中埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia/Shigella）的相對豐度僅為模型對照組的2.54%。Jensen等[38]研究發現，埃希氏菌屬、顫螺菌屬、梭菌屬和瘤胃球菌屬可能會增加炎癥發生的風險。同時，葡萄籽多酚提取物干預能夠顯著增加乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、狄氏副擬桿菌屬（Parabacteroides distasonis）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、坦納擬普雷沃菌屬（Alloprevotella tannerae）、別樣棒菌屬（Allobaculum）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）的相對豐度，且葡萄籽多酚提取物低劑量組中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對豐度是模型對照組的1.38倍和56.72倍。Ejtahed等[39]研究發現，乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等益生菌具有顯著的益生效果，包括抑制致病菌、改善腸道菌群結構、增強機體免疫功能等功效。Ren等[40]研究發現，乳酸菌屬和雙歧桿菌屬等腸道益生菌屬，其數量與機體免疫能力在一定程度上呈正相關。Hua等[41]研究亦證明，乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬等益生菌能夠刺激機體免疫功能，上調抗炎細胞因子，抑制機體炎癥反應，其代謝產物還能促進腸上皮細胞的修復和再生，從而有效減少脂多糖的吸收。此外，Nami等[42]發現，乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌有利于調節腸道杯狀細胞的功能和促進腸上皮釋放IgA和防御素等，同時二者有助于改善免疫系統應答、抑制病原菌的定植以及增強腸道上皮屏障[43]。

2.6 小鼠盲腸中短鏈脂肪酸含量的測定結果

膳食多酚類物質可能引起某些特定腸道微生物的數量變化，而腸道微生物也會影響多酚類物質的轉化途徑和過程，如短鏈脂肪酸的產生[44]，乙酸、丙酸與丁酸在腸道中的含量最高，是腸道中主要的短鏈脂肪酸[45]。由表3可知，小鼠經過CPA造模后，與模型對照組相比，葡萄籽多酚提取物干預后，小鼠盲腸中乙酸、丙酸、丁酸含量顯著升高（P＜0.05），與Henning等[46]、Sun等[47]的研究結果相似。短鏈脂肪酸可通過腸上皮細胞進入并與宿主細胞相互作用，吸收后在血清中循環并影響宿主的免疫反應和發生疾病的風險，并可抑制具有促進維持免疫穩態的抗炎型細胞作用的組蛋白脫乙酰酶[48]。

表3 葡萄籽多酚對免疫抑制小鼠盲腸中短鏈脂肪酸含量的影響Table 3 Effect of grape seed polyphonel on short-chain fatty acids contentsin cecum of mice 單位：mmol/L

2.7 短鏈脂肪酸與腸道菌群分布的相關性分析

短鏈脂肪酸的濃度與腸道菌群與膳食密切相關[49]。經Pearson相關分析可以得知，短鏈脂肪酸與腸道菌群的變化量存在相關性，如表4所示。其中：蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、坦納擬普雷沃菌屬（Alloprevotella）、別樣棒菌屬（Allobaculum）、Romboutsia屬、歐氏菌屬（Olsenella）、Murimonas屬、嗜膽菌屬（Bilophila）與乙酸、丙酸、丁酸含量存在顯著正相關（P＜0.05）；乳酸球菌屬（Lactococcus）及乳酸桿菌屬（Lactobacillus）與丙酸、丁酸含量存在顯著正相關（P＜0.05）；雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）與乙酸、丙酸含量存在顯著正相關（P＜0.05）。說明這些菌屬會在腸道中分解植物多酚等營養物質促進短鏈脂肪酸的生成，短鏈脂肪酸通過腸上皮細胞進入并與宿主細胞相互作用，吸收后在血清中循環并影響宿主的免疫反應和發生疾病的風險[48]。Jensen等[38]的研究亦表明，乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬等益生菌可以通過分泌短鏈脂肪酸誘導和調節T細胞的增殖和分化，塑造腸道內穩定的免疫系統，這就從代謝產物的角度驗證了益生菌的益生作用。但Catabacter屬與乙酸、丙酸、丁酸含量存在顯著負相關（P＜0.05）；另枝菌屬（Alistipes）及臭味菌屬（Odoribacter）與乙酸含量存在顯著負相關（P＜0.05）；厭氧原體屬（Anaeroplasma）與丁酸含量存在顯著負相關（P＜0.05），這說明短鏈脂肪酸可以抑制Catabacter屬、另枝菌屬（Alistipes）、臭味菌屬（Odoribacter）及厭氧原體屬（Anaeroplasma）等病原菌的增殖。Sanz等[50]研究表明，雙歧桿菌屬及乳酸桿菌屬的生長與短鏈脂肪酸的生產有關，與本研究得到的結論一致。

表4 短鏈脂肪酸與腸道菌群分布之間的相關性系數分析表Table 4 Analvsis of correlation coefficient between SCFAsand gut microbiota distribution

3 結論

以葡萄籽多酚為研究對象，通過環磷酰胺誘導建立免疫抑制小鼠模型，利用Illumina MiSeq高通量測序平臺探究葡萄籽多酚對免疫抑制小鼠腸道菌群的影響。結果表明：葡萄籽多酚干預能夠提高小鼠的胸腺、脾臟指數以及免疫球蛋白（sIgA、IgM、IgG）含量，增強小鼠免疫功能；低劑量葡萄籽多酚干預能夠提高腸道菌群多樣性，促進乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、狄氏副擬桿菌屬、雙歧桿菌屬、蘇黎世桿菌屬、坦納擬普雷沃菌屬、別樣棒菌屬、Romboutsia屬的生長，抑制巴恩斯氏菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬、艾克曼菌屬的生長；同時，乳酸桿菌屬及雙歧桿菌屬等益生菌的增殖，有利于促進SCFAs的產生，進而增強機體免疫能力。該研究結果不僅為植物多酚改善人體健康提供可靠的理論依據，還為以腸道菌群為靶點通過益生元的攝入來預防各類慢性疾病帶來了全新的思路和方法，將在保健食品、特殊醫學用途食品等領域具有良好的應用前景。