對硫磷等6種農(nóng)藥殘留熒光免疫檢測芯片的研發(fā)及應用

王兆芹 汪彤 崔海峰 趙正苗 萬宇平 索金玉

摘 ? 要：本文通過制備試紙條的核心結(jié)構——熒光免疫檢測芯片，研制出一種能夠同時檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯這6種農(nóng)藥殘留的熒光免疫層析矩陣試紙條。該試紙條的對硫磷檢測限為果蔬0.02mg/kg，毒死蜱檢測限為果蔬0.5mg/kg，辛硫磷檢測限為果蔬10mg/kg，甲氰菊酯檢測限為水果5mg/kg、蔬菜1mg/kg，氯氰菊酯檢測限為果蔬0.5mg/kg，溴氰菊酯檢測限為水果0.1mg/kg、蔬菜0.5mg/kg;檢測時間為5min，假陽性率和假陰性率均為0。

關鍵詞：有機磷類農(nóng)藥 ?菊酯類農(nóng)藥 ?熒光免疫層析試紙條 ?快速檢測

引言

有機磷類農(nóng)藥與菊酯類農(nóng)藥是蔬菜與水果中常用的兩大類農(nóng)藥——對硫磷、毒死蜱、辛硫磷是有機磷類農(nóng)藥中的典型代表，甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯則是菊酯類農(nóng)藥中的典型代表，這兩類農(nóng)藥常常交替使用以降低害蟲產(chǎn)生抗藥性的幾率。然而，農(nóng)藥可經(jīng)消化道、呼吸道及完整的皮膚和粘膜進入人體，從而對身體產(chǎn)生危害。因此，檢測果蔬產(chǎn)品中的對硫磷等有機磷類農(nóng)藥和甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥具有必要性。

目前，檢測有機磷類農(nóng)藥和菊酯類農(nóng)藥的方法主要包括氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-4]、氣相色譜[5-8]、高效液相色譜法[9-11]、超高效液相色譜[12]、液相色譜法[13]等儀器方法，但此類方法的成本較高、用時較長，免疫化學檢測法則具有低成本、用時較短、特異性較強等優(yōu)點[14-15]。本文制備出一種能夠同時檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯這6種農(nóng)藥殘留的熒光免疫層析矩陣試紙條——消耗費用及檢測時限均能夠滿足基層實驗室的檢測需求，故具有實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等標準品（純度≥95%），購自北京標準物質(zhì)研究中心;抗體、包被原、羊抗鼠抗抗體、熒光分析儀，由北京勤邦生物技術有限公司提供;時間分辨熒光微球，購自蘇州為度生物技術有限公司;渦旋儀，購自湖南湘立科學儀器有限公司[14-15]。

1.2 方法

1.2.1 制備對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯殘留六合一熒光試紙條

對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等藥物的抗體分別用熒光微球標記，將標記物分別噴涂到試紙條的核心結(jié)構熒光免疫檢測芯片上，即在檢測線1（T1線）上包被對硫磷包被原、在檢測線2（T2線）上包被毒死蜱包被原、在檢測線3（T3線）上包被辛硫磷包被原、在檢測線4（T4線）上包被甲氰菊酯包被原、在檢測線5（T5線）上包被氯氰菊酯包被原、在檢測線6（T6線）上包被溴氰菊酯包被原，在質(zhì)控線（C線）上包被羊抗鼠抗抗體。組裝上述結(jié)構，制備出對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯殘留六合一熒光試紙條。

1.2.2 檢測方法

用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加2～3滴于加樣孔中，當液體流動時開始計時，反應5min時通過熒光分析儀讀取檢測結(jié)果，其它時間判讀無效。

1.2.3 樣本檢測限

在空白柑橘、空白白菜樣本中添加對硫磷標準品至質(zhì)量濃度為0、0.01、0.02、0.04ppm;在空白柑橘、空白白菜樣本中添加毒死蜱標準品至質(zhì)量濃度為0、0.25 、0.5、1.0ppm;在空白柑橘、空白白菜樣本中添加辛硫磷標準品至質(zhì)量濃度為0、5、10、20 ppm;在空白柑橘樣本中添加甲氰菊酯標準品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、10ppm，在空白白菜樣本中添加甲氰菊酯標準品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1、2ppm;在空白柑橘、空白白菜樣本中添加氯氰菊酯標準品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm;在空白柑橘樣本中添加溴氰菊酯標準品至質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.2ppm，在空白白菜樣本中添加溴氰菊酯標準品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm。按照“1.2.2”所述方法用3批試紙條進行檢測，每個濃度重復5次，根據(jù)實驗結(jié)果確定樣本檢測限[14-15]。

1.2.4 試紙條的特異性

分別配制10mg/kg的腐霉利、克百威、滅蠅胺等藥物，用試紙條重復檢測3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.5 試紙條的準確性

農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示熒光免疫層析法的準確性[14-15]。取經(jīng)儀器確證的50份陰性果蔬樣品（質(zhì)量濃度小于檢測限）與50份陽性果蔬樣品（質(zhì)量濃度大于檢測限），用該試紙條檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的藥物殘留量，計算假陽性率和假陰性率[14-15]。《農(nóng)殘辦技術材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應小于5%，假陰性率應為零[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢測限

按照“1.2.3”在空白樣本中添加藥物標準品至一定的質(zhì)量濃度，進行檢測，并確定檢測限[14-15]。

2.2 特異性

采用該試紙條檢測10mg/kg的腐霉利、克百威、滅蠅胺等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.3 準確性

用試紙條檢測50份陰性果蔬樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用試紙條檢測50份陽性果蔬樣品，試紙條檢測結(jié)果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術材料要求及審查程序》的要求[14-15]。

3 討論

本文制備出試紙條的核心結(jié)構——熒光免疫檢測芯片，研制出一種能夠同時檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯這6種農(nóng)藥殘留的熒光免疫層析矩陣試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術材料要求及審查程序》的要求對試紙條進行了特異性、準確性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時間僅為5min，比現(xiàn)有文獻中的儀器方法用時更短，操作更簡便。試紙條的對硫磷檢測限為果蔬0.02mg/kg，毒死蜱檢測限為果蔬0.5mg/kg，辛硫磷檢測限為果蔬10mg/kg，甲氰菊酯檢測限為水果5mg/kg、蔬菜1mg/kg，氯氰菊酯檢測限為果蔬0.5mg/kg，溴氰菊酯檢測限為水果0.1mg/kg、蔬菜0.5mg/kg，靈敏度較高。

參考文獻：

[1] 張艷，陳子雷，郭長英，丁蕊艷，張文君，毛江勝，李慧冬.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定韭菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2021，12（04）：1463-1467.

[2] 張群，馬晨，秦安麗，段云，郇志博，吳瓊.QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定豇豆中6種菊酯農(nóng)藥殘留[J].中國測試，2021，47（02）：63-67.

[3] 鞠芬，楊曉云，黃其亮，鐘濤，鞠榮.氣相色譜質(zhì)譜法測定環(huán)境水樣中百菌清及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的不確定度評定[J].廣東化工，2021，48（02）：160-162.

[4] 張琪瑋，李銘.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS/MS）測定蔬菜中氯氰菊酯的不確定度評定[J].農(nóng)業(yè)科技與信息，2020（23）：55-58.

[5] 朱雪琴，趙薇，陳坦林，朱鵬程，熊婷婷.改良QuEChERS法提取-氣相色譜-火焰光度檢測同時測定茶葉中5種有機磷農(nóng)藥殘留[J].分析科學學報，2018，34（02）：176-180.

[6] 趙建虎.氣相色譜法測定地表水中的3種菊酯類農(nóng)藥殘留[J].輕工科技，2021，37（01）：111-112+116.

[7] 余霞奎，趙蕓，林啟存，童朝明.氣相色譜法測定水體中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留[J].浙江農(nóng)業(yè)科學，2005（01）：70-71.

[8] 楊元，高玲，景露，譙斌宗，譚穎.SPE-GC/MS法測定水中有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥[J].中國測試，2009，35（02）：86-89.

[9] 吳飛，邵愛梅，徐曉培.高效液相色譜法測定飲用水中莠去津、三氯殺螨醇、氰戊菊酯、甲氰菊酯和二氯苯醚菊酯[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學，2020，47（19）：3619-3622.

[10] 王博文，唐愛星，韋瀅軍，陳振.雙水相萃取-高效液相色譜法檢測高效氯氰菊酯及其降解產(chǎn)物[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（03）：268-271.

[11] 赫彩霞，王姣姣，高文惠.高效液相色譜-DAD法檢測糧谷作物中多種菊酯類農(nóng)藥殘留[J].糧食與油脂，2015，28（04）：58-60.

[12] 吳春英，谷風，白鷺，陸文龍.固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用同時測定水中菊酯類農(nóng)藥多殘留[J].分析科學學報，2017，33（01）：57-62.

[13] 李春民，章承林，陳懷俠.固相萃取-液相色譜法分析環(huán)境水樣中有機磷農(nóng)藥殘留[J].湖北大學學報（自然科學版），2012，34（02）：164-167+211.

[14] 吳小勝，賈芳芳，崔海峰，等.一種苯醚氰菊酯膠體金免疫快速檢測試紙條的研制[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2020，59（7）：196-198，203.

[15] 朱亮亮，王琳琛，王兆芹，崔海峰，張坤，馮才偉，萬宇平.檢測4種有機磷農(nóng)藥膠體金免疫層析試紙條的研制[J].山東畜牧獸醫(yī)，2019，40（08）：10-12.

基金項目：典型性農(nóng)殘多靶標高效快速檢測技術研究與應用（Z181100009318006）項目。

作者簡介：王兆芹（1976-），女，籍貫黑龍江，中級工程師，研究方向為食品安全檢測技術研究。