一測多評法同時測定尖葉假龍膽中龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮及雛菊葉龍膽酮

張 闖，陳世雨，周偉偉，劉興超,2,3，楊洪霞，徐耿瑞，李愛英,2,3*

1.河北中醫學院，河北 石家莊 050200

2.河北省心腦血管病中醫藥防治重點實驗室，河北 石家莊 050091

3.河北省高校中藥組方制劑應用技術研發中心，河北 石家莊 050091

龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽Gentianella acuta(Michx.) Hulten 為一年生草本植物，廣泛分布于我國東北、華北、西北各省，據《內蒙古植物藥志》記載：“尖葉假龍膽全草入藥，味苦、性涼，有清熱、解毒之功效，可用于治療黃疸型肝炎、發燒、頭痛等”[1-5]，而鄂倫春族牧民將其煎煮后口服，用來治療心律失常、冠心病、心絞痛等心血管疾病，療效顯著[6-8]。尖葉假龍膽中成分復雜[9-10]，包括酮類、黃酮類、環烯醚萜類、木脂素類、甾體類等[2]。現代藥理學研究表明，尖葉假龍膽藥材及其提取液具有抑制心肌纖維化、改善心功能[11-13]、抗腫瘤[14-15]、護肝[16]、抗炎[17]、抗氧化[18]、改善胰島素抵抗[19-20]等作用。因此，通過對尖葉假龍膽藥材及其提取液中化合物成分進行定性與定量研究，建立尖葉假龍膽質量控制標準具有重要意義。

高效液相色譜法是現代中藥研究中的重要方法，能夠對中藥中所含成分進行定性與定量檢測[21]。尖葉假龍膽中多數對照品價格相對較高，為了節約檢測成本，探索多指標質量控制模式。本課題組采用一測多評（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）的方法，同時測定尖葉假龍膽中6 種成分[22]的含量，以雛菊葉龍膽酮為內參物，計算其與龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素和去甲基雛菊葉龍膽酮的相對校正因子，通過校正因子計算出其他成分的含量，以期為尖葉假龍膽的多成分質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司），Ultimate 3000 雙三元液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司），SPD-M20A 高效液相色譜儀（日本島津公司），UV-9000 紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司），ME204E/02 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），Milli-Q 超純水機（美國密理博公司）。

1.2 試劑

對照品龍膽苦苷（批號6480907-2）、芒果苷（批號12759-74-8）、當藥醇苷（批號136656-07-0）、木犀草素（批號4773-96-0）、去甲基雛菊葉龍膽酮（批號113558-15-9）、雛菊葉龍膽酮（批號41059-79-4），均購于南京元寶峰醫藥科技有限公司，各對照品質量分數均≥98%，可供含量測定用。乙腈（色譜純，Fisher 公司），超純水為實驗室自制。

1.3 藥材

藥材樣品于2014年至2019年每年采集1 次，共6 批（S1～S6），經河北中醫學院藥學院鄭玉光教授鑒定為龍膽科假龍膽屬植物尖葉假龍膽Gentianella acuta(Michx.) Hulten。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 取各對照品適量分別加甲醇配制成含龍膽苦苷0.37 mg/mL，芒果苷0.36 mg/mL，當藥醇苷0.44 mg/mL，木犀草素0.33 mg/mL，去甲基雛菊葉龍膽酮0.29 mg/mL，雛菊葉龍膽酮0.31 mg/mL 的對照品溶液，同時分別取等體積對照品配制6 種對照品的混合溶液，即混合對照品搖勻，4 ℃冷藏備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取尖葉假龍膽粉末（過3 號篩）約0.5 g，精密加入甲醇50 mL，回流提取30 min，放冷，用提取溶劑補足減失的質量，搖勻。濾過，濾液過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.2 色譜條件

Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～4 min，5%～16% A；4～7 min，16%～30% A；7～9 min，30%～45% A；9～17 min，45%～90% A；17～38 min，90%～100% A；38～45 min，100% A）；柱溫35 ℃；體積流量0.5 mL/min；檢測波長254 nm，進樣體積10 μL，混合對照品和供試品溶液HPLC 色譜圖，見圖1。

圖1 尖葉假龍膽混合對照品 (A) 和尖葉假龍膽樣品 (B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and samples (B) of G.acuta

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性范圍考察 將“2.1.1”項下制備的對照品溶液分別稀釋至對照品溶液濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16 倍，按照“2.2”項下色譜條件依次進樣，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制各對照品的回歸方程，結果見表1。

表1 尖葉假龍膽中6 種成分的線性關系考察結果Table 1 Linear relationship of six detected components of G.acuta

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下制備的混合對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件連續進樣6 次，計算得到龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積RSD 分別為1.13%、0.87%、1.74%、2.53%、1.44%、1.69%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密吸取“2.1.2”項下制備的尖葉假龍膽供試品溶液，分別于溶液配好后0、2、4、6、8、12、24、48 h，按照“2.2”項下色譜條件依次進樣測定。結果龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積RSD 分別為1.26%、1.72%、1.38%、1.58%、0.69%、0.97%，表明供試品溶液在48 h 內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批尖葉假龍膽的粉末6份，按 “2.1.2”項下方法制備6 份供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算尖葉假龍膽中龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的平均質量分數，計算其RSD 分別為0.81%、1.06%、1.42%、1.28%、1.49%、0.93%，表明方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取尖葉假龍膽藥材粉末約0.25 g，精密稱定，平行6 份，分別加入與尖葉假龍膽藥材粉末各成分相等含量的對照品溶液，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，“2.2”項下色譜條件進樣檢測，計算加樣回收率。結果顯示龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的加樣回收率分別為99.91%、100.43%、99.95%、100.56%、99.86%、100.05%，RSD 分別為1.04%、1.51%、1.85%、2.28%、0.53%、1.48%，表明方法準確度良好。

2.4 相對校正因子（fs/i）的建立

本實驗采用多點矯正法。根據fs/i＝fs/fi＝As×Ci/(Ai×Cs)計算QAMS 的fs/i，式中fs/i為內標物對待測組分i的校正因子，As為內標物峰面積，Cs為內標物濃度，Ai為待測組分i峰面積，Ci為待測組分i濃度。以雛菊葉龍膽酮為內參物，根據公式分別計算雛菊葉龍膽酮對龍膽苦苷（A）、芒果苷（B）、當藥醇苷（C）、木犀草素（D）和去甲基雛菊葉龍膽酮（E）的fs/i，結果見表2。

表2 各組分的fs/i 測定結果Table 2 fs/i values of each component

2.5 fs/i 耐用性評價

2.5.1 不同高效液相色譜儀和色譜柱對fs/i的影響 分別考察了 Waters e2695、Ultimate 3000 和SPD-M20A 3 種液相色譜儀和Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）2 種色譜柱對fs/i的影響，結果顯示各成分在不同高效液相色譜儀和不同色譜柱上的fs/i的RSD 分別為1.52%、0.58%、2.02%、0.69%、1.75%，均小于3%，見表3，說明不同高效液相色譜儀和不同色譜柱對各成分的fs/i無明顯影響。

表3 不同儀器與色譜柱對各成分fs/i 的影響Table 3 Effect of different instruments and columns on fs/i of each component

2.5.2 不同進樣體積對fs/i的影響 分別精密吸取不同體積（1、2、4、8、10、15、20 μL）的混合對照品溶液，依次注入高效液相色譜儀中進行檢測，記錄1～6 號色譜峰峰面積，考察不同進樣體積對fs/i的影響。結果表明，進樣體積的改變對尖葉假龍膽各成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD 均小于3%，結果見表4。

表4 不同進樣體積對各組分fs/i 的影響Table 4 Effect of different injection volumes on fs/i of each component

2.5.3 不同色譜柱柱溫對fs/i的影響 精密吸取等量“2.1.1”項下制備的尖葉假龍膽混合對照品溶液5 份，采用Waters e2695 高效液相色譜儀，Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），分別使用不同柱溫（25、30、35、40、45 ℃）對混合對照品溶液進行檢測，記錄龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積，考察不同柱溫對fs/i的影響。結果表明，柱溫的改變對尖葉假龍膽各個成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD 均小于2%，結果見表5。

表5 不同柱溫對各組分fs/i 的影響Table 5 Effect of different column temperatures on fs/i of each component

2.5.4 不同流動相體積流量對fs/i的影響 精密吸取等量混合對照品溶液5 份，分別注入高效液相色譜儀中，使用不同流動相體積流量（0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL/min）進行檢測，記錄龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積，考察不同流動相體積流量對fs/i的影響。結果表明，流動相體積流量的改變對尖葉假龍膽各成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD 均小于2%，結果見表6。

表6 不同流動相體積流量對各組分fs/i 的影響Table 6 Effect of different flow rates on fs/i of each component

2.5.5 檢測波長的微小改變對fs/i的影響 精密吸取等量“2.1.1”項下制備的尖葉假龍膽混合對照品溶液3 份，分別注入高效液相色譜儀中，分別在252、254、256 nm 波長下檢測，記錄龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的峰面積，考察不同波長對fs/i的影響。結果表明，檢測波長的微小改變對尖葉假龍膽各成分fs/i無明顯影響，各成分fs/i的RSD均小于1%，結果見表7。

表7 不同檢測波長對各組分fs/i的影響Table 7 Effect of different detection wavelengths on fs/i of each component

2.6 待測成分的色譜峰定位

通過計算在不同色譜儀和不同色譜柱中，尖葉假龍膽各組分的色譜峰與雛菊葉龍膽酮色譜峰的相對保留時間（ts/i），對各待測組分進行定位，結果見表8。結果顯示，不同儀器與色譜柱測得的ts/i的RSD分別為1.06%、0.76%、0.62%、1.08%、0.94%，均小于2%，表明可以以ts/i對尖葉假龍膽中各組分的色譜峰進行定位。

表8 不同儀器與色譜柱測得各成分ts/iTable 8 Relative retention time of different instruments and columns

2.7 QAMS 與外標法測定結果的比較

取6 批不同采集時間的尖葉假龍膽藥材粉末制成供試品溶液，精密吸取10 μL 注入液相色譜儀進行測定。分別采用QAMS 和外標法計算6 批尖葉假龍膽中龍膽苦苷、芒果苷、當藥醇苷、木犀草素、去甲基雛菊葉龍膽酮、雛菊葉龍膽酮的含量，每批3 份，結果見表9。將QAMS 法與外標法測得的各組分含量進行比較，發現2 種方法測得的6 種組分含量基本一致，RSD 小于3%，說明該QAMS 法可以替代外標法用于尖葉假龍膽藥材的含量測定。

表9 QAMS 法與外標法測定6 批尖葉假龍膽中6 種成分含量Table 9 Content of six components in six batches of G.acuta by QAMS and ESM

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法考察

本實驗前期考察了尖葉假龍膽提取條件和高效液相色譜條件，應用超聲與回流2 種提取方法，在不同提取溶劑（甲醇、乙醇、水、醋酸乙酯），不同提取時間下（20、30、40、60、90 min）進行嘗試，最終確定以甲醇溶液回流提取30 min 為最佳提取方法。應用此法方法提取尖葉假龍膽6 種成分效果最好。

3.2 不同年份采集的尖葉假龍膽中6 種成分的比較

HPLC 檢測方法采用紫外檢測器，在254 nm 檢測波長下，以乙腈-0.1%冰醋酸水溶液為流動相，梯度洗脫。本實驗考察了最近6年收集的尖葉假龍膽中6 種組分含量差異。結果表明，最近6年的尖葉假龍膽藥材中6 種組分含量沒有明顯變化，說明尖葉假龍膽可長期放置。

為了建立較為全面地對尖葉假龍膽質量評價方法，本實驗選擇尖葉假龍膽中含量較高的3 類化合物：酮類化合物、黃酮類化合物和環烯醚萜化合物作為質量評價指標，其中酮類化合物選擇當藥醇苷、芒果苷、龍膽山酮酚和雛菊葉龍膽酮為研究對象，黃酮類化合物選擇木犀草素為研究對象，環烯醚萜類化合物選擇龍膽苦苷為研究對象。本實驗建立了QAMS 法結合HPLC-UV 技術，同時測定尖葉假龍膽藥材提取液中酮、黃酮和環烯醚萜3 類共6 種組分的含量方法，以尖葉假龍膽中含量較高且性質穩定的雛菊葉龍膽酮為內標物，根據內標物的含量結合各組分之間的fs/i計算尖葉假龍膽中其他5 種組分的含量。結果顯示，該QAMS 法與外標法測得的各組分含量基本一致，所測結果具有較高的可信度和較好的可行性，為尖葉假龍膽質量控制提供了較為全面的理論參考，也為尖葉假龍膽的多指標質量控制模式提供了新方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突