黃連-厚樸配伍抑制PI3K/Akt信號通路改善TNBS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎研究

楊顯娟，付 尹，王佳俊，王 建*，肖琳萱，徐 卓，王立映，龔道銀

1.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都 611137

2.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610075

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種炎癥性腸病，發病部位僅限于結腸和直腸，病因尚不明確[1]。據統計，全球UC 總患病率為0.4%[2-4]。黃連、厚樸為2 種傳統的中草藥，具有抗菌、抗氧化、止瀉和消炎的作用，臨床常將2 藥配伍聯用，厚樸制約黃連苦寒藥性，二者又可協同增效，且安全性更高?，F代藥理學研究表明，黃連的主要活性成分小檗堿對UC 具有抗炎、調節免疫、保護腸黏膜屏障和維持腸道菌群平衡的作用[5-6]；厚樸的主要活性成分厚樸酚對UC 也具有較好的保護作用[7]。本課題組前期研究發現，黃連、厚樸單獨或配伍使用對UC 均具有保護作用[8]。本研究采用生物信息學分析技術預測黃連-厚樸活性成分與活動性UC 之間復雜的網絡關系，系統性地評估黃連與厚樸治療UC的生物學過程和可能調控的信號通路，并結合實驗驗證，為闡明黃連-厚樸配伍的作用機制提供依據。

1 方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 靶點預測 從GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）[9]下載GSE75214 基因表達譜數據，以P＜0.05 且|log2FC|≥1 為標準，篩選差異基因，其中log2FC≥1 代表上調的差異表達基因，log2FC≤?1 代表下調的差異表達基因。

通過中醫藥系統藥理學平臺（TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）[10]收集黃連、厚樸的活性成分，根據口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug likeness，DL）≥0.15篩選活性成分，同時利用SwissTargetPrediction 數據庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）[11]預測活性成分的作用靶點。

1.1.2 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建和功能富集分析 利用R 語言將黃連-厚樸活性成分靶點與UC特異性差異基因取交集，繪制韋恩圖，采用STRING 數據庫（https://string-db.org）[12]構建 PPI 網絡。采用CytoScape 軟件[13]對交集靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2 實驗驗證

1.2.1 動物 SPF 級SD 大鼠48 只，雌雄各半，8周齡，體質量（220±20）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，動物合格證號SCXK（川）2020-030。動物于成都中醫藥大學實驗動物中心適應性飼養5 d，溫度（25.0±0.5）℃、濕度50%，通風良好，保持明暗交替，自由進食飲水。動物實驗經成都中醫藥大學實驗動物臨床委員會批準（批準號TCM-2016-312）。

1.2.2 藥材 黃連、厚樸購自成都荷花池中藥材市場，經成都中醫藥大學李敏教授鑒定分別為黃連Coptis chinensisFranch.的干燥根莖、厚樸Magnolia officinalisRehd.et Wils.的干燥干皮、枝皮及根皮。采用高效液相色譜法（HPLC）測得黃連中小檗堿質量分數為7.44%（以鹽酸小檗堿計），厚樸中厚樸酚與和厚樸酚的總質量分數為3.19%，均符合《中國藥典》2020年版規定。

1.2.3 藥品與試劑 2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS，批號P2297）購自美國Sigma 公司；柳氮磺胺吡啶腸溶片（批號09180709，0.25 g/片）購自上海信宜天平藥業有限公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（批號YX-091201R）、IL-6 檢測試劑盒（批號YX-091221R）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（批號YX-201406R）、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）檢測試劑盒（批號YX-131615R）購自上海優選生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號202001）購自北京索萊寶科技有限公司；β-actin抗體（批號T0022）購自美國Affinity 公司；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號4685S）、剪切型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）抗體（批號9661S）購自美國CST 公司；磷酸化Akt（p-Akt）抗體（批號AB38449）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）抗體（批號AB182651）購自英國Abcam 公司；B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號109683）購自美國GeneTex 公司；HRP 標記的山羊抗兔IgG抗體（批號143146）購自美國Jackson Immuno Research 公司。

1.2.4 儀器 L3-5K 型高速離心機（湖南可成儀器設備有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；XD30型顯微鏡（日本Olympus 公司）；DG5032 型酶標儀（上海珂淮儀器有限公司）；TSY-B 型搖床（天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司）；JB-P5 型包埋機（常州派斯杰醫療設備有限公司）；RM2235 型石蠟切片機（德國Leica 公司）。

1.2.5 造模、分組與給藥 SD 大鼠禁食不禁水24 h后，取40 只大鼠采用TNBS/乙醇法[14]制備UC 模型。聚乙烯軟管經石蠟潤滑后插入大鼠直腸，深度約8 cm，向聚乙烯軟管中緩慢注入的TNBS/乙醇溶液（1 mL/kg），為防止藥液停留在軟管中，藥液注入完畢后，繼續注入0.4 mL 空氣，并將大鼠倒立，保持肛門高位2 min，以防止藥液倒流，使藥液均勻分布在直腸中；取8 只大鼠作為對照組，注入等體積0.9%氯化鈉溶液。黃連、厚樸和黃連-厚樸配伍水提物的制備及劑量設置參照本課題組前期研究方法[8]，將造模成功的40 只大鼠隨機分為模型組、黃連（2 g/kg）組、厚樸（2 g/kg）組、黃連-厚樸配伍（4 g/kg）組和柳氮磺胺吡啶（0.4 g/kg，相當于臨床等效劑量）組，每組8 只。造模24 h 后，各給藥組ig 相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/d，持續6 d。

1.2.6 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α水平和MPO 活性的影響 末次給藥24 h 后，稱定大鼠體質量，深度麻醉，腹主動脈取血，3500 r/min離心10 min，收集上清液，按試劑盒說明書檢測血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性。

1.2.7 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸質量/長度、脾臟指數和腸黏膜損傷指數（colon macroscopic damage index，CMDI）評分的影響 大鼠腹主動脈取血后，取結腸和脾臟組織，稱定質量，將結腸平鋪在方格紙上測量結腸長度，并進行CMDI評分[15]：0 分為黏膜無損傷、充血；1 分為局部黏膜充血水腫，但無糜爛、潰瘍形成；2 分為黏膜有潰瘍形成、充血，但炎性反應與潰瘍僅顯點狀不顯著；3 分為在2分的基礎上，黏膜潰瘍、充血范圍直徑超過4 mm，炎性反應顯著；4 分為在3 分的基礎上，黏膜潰瘍、充血、炎性反應更嚴重，并有結腸增厚現象；5 分為在4 分的基礎上，潰瘍面積直徑超過1 cm，結腸明顯充血、增厚；6 分為在5 分的基礎上，潰瘍形成超過2 cm 且糜爛，結腸增厚。

1.2.8 黃連-厚樸配伍對UC大鼠結腸組織病理變化的影響 各組大鼠取靠近直腸的結腸組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，經脫水、透明、包埋、切片、貼片、烤片后，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下結腸組織病理變化，并進行病理損傷程度評分，評分標準見表1。

表1 結腸組織病理損傷評分標準Table 1 Scoring criteria of colonic histopathological damage

結腸組織病理損傷評分＝(炎性細胞浸潤＋組織結構的完整性)/2

1.2.9 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達的影響 取各組大鼠結腸組織，包埋后切片（厚2 μm），脫蠟、水化、抗原修復、阻斷、封閉后，分別滴加Akt 抗體（1∶100）、PI3K 抗體（1∶100）、cleaved Caspase-3 抗體（1∶400），4 ℃孵育過夜；加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體孵育，于顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J 軟件分析結腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達情況。

1.2.10 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響 取大鼠結腸組織，加入預冷的RIPA 裂解液（含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑），提取蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，封閉后，分別加入p-Akt、Akt、Bcl-2、cleaved Caspase-3 和β-actin 抗體，孵育過夜；加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體，孵育后加入ECL 發光液顯影，采用Image J 軟件分析條帶。

1.2.11 統計分析 采用SPSS 26.0 軟件進行統計，使用單因素方差分析（One-way ANOVA）結合事后檢驗進行組間分析。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 UC 差異基因的表達 GSE75214 基因表達譜數據包括11 例正常結腸組織樣本和74 例活動性UC 結腸組織樣本，根據P＜0.05 且|log2FC|≥1 共篩選出1243 個差異表達基因，包括794 個表達上調的差異基因和449 個表達下調的差異基因，見圖1。

圖1 UC 結腸組織差異表達基因的火山圖Fig.1 Volcano map of differentially expressed genes in UC colon tissue

2.1.2 PPI 網絡分析 如表2 所示，TCMSP 數據庫共檢索到黃連-厚樸活性成分22 個，其中黃連14 個、厚樸8 個。如圖2、3 所示，共預測出260 個靶點，將篩選的黃連-厚樸活性成分靶點與UC差異基因靶點取交集，得到49 個共同靶點。

表2 黃連-厚樸的活性成分Table 2 Active components of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex

圖2 黃連-厚樸活性成分靶點與UC 差異基因靶點的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of targets of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex active components and UC differential genes

2.1.3 GO 功能和KEGG 通路富集分析 GO 功能富集分析如圖4 所示，生物過程（biological process，BP）主要集中在對細胞因子介導的信號通路、炎性反應的調節、細胞程序性死亡的正向調節等；細胞 組成（cellular component，CC）主要集中在細胞膜、肥大細胞顆粒、基底外側質膜等；分子功能（molecular function，MF）主要表現在碳酸鹽脫水酶活性、蛋白激酶活性、氧化還原酶活性等。KEGG通路富集分析如圖5 所示，主要參與過氧化物酶體增殖物活化受體（peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR）信號通路、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和PI3K-Akt 信號通路等。

2.2 實驗驗證

2.2.1 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性的影響 如表3所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性顯著降低（P＜0.01），尤其以黃連-厚樸配伍組最佳，提示黃連-厚樸配伍對UC 大鼠的抗炎作用優于單用黃連、厚樸。

2.2.2 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸質量/長度、脾臟指數和CMDI 評分的影響 如表4 所示，與對照組比較，模型組大鼠結腸質量/長度、脾臟指數和CMDI 評分均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組結腸質量/長度、脾臟指數和CMDI評分均顯著降低（P＜0.01），尤其以黃連-厚樸配伍組最佳，提示黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸黏膜的保護作用優于單用黃連、厚樸。

圖3 黃連-厚樸活性成分靶點與UC 特征性基因靶點的PPI 網絡Fig.3 PPI network of targets of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex active components and UC characteristic genes

圖4 GO 功能富集分析Fig.4 GO function enrichment analysis

圖5 KEGG 通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

表3 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性的影響 ( ± s , n=8)Table 3 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on IL-1β, IL-6, TNF-α levels and MPO activity in serum of UC rats ( ± s , n=8)

表3 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平和MPO 活性的影響 ( ± s , n=8)Table 3 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on IL-1β, IL-6, TNF-α levels and MPO activity in serum of UC rats ( ± s , n=8)

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，下表同##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg?1) IL-1β/(pg·mL?1) IL-6/(pg·mL?1) TNF-α/(pg·mL?1) MPO/(U·L?1) 對照 — 447.56±31.04 23.84±1.92 184.50±14.80 306.20±46.31 模型 — 865.38±15.48## 57.93±2.76## 389.28±17.91## 675.79±42.78## 黃連 2 577.95±26.93** 34.89±3.50** 275.14±25.03** 450.71±59.64** 厚樸 2 585.65±26.93** 38.10±3.13** 295.30±15.35** 502.74±34.04** 黃連-厚樸配伍 4 537.26±45.96** 31.72±3.05** 249.44±25.19** 394.63±19.20** 柳氮磺胺吡啶 0.4 623.49±32.17** 45.41±3.21** 318.04±14.72** 546.85±38.44**

表4 黃連-厚樸對UC 大鼠結腸質量/長度、脾臟指數和CMDI 評分的影響 ( ± s , n=8)Table 4 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on colon weight/length, spleen index and CMDI score in UC rats ( ± s , n=8)

表4 黃連-厚樸對UC 大鼠結腸質量/長度、脾臟指數和CMDI 評分的影響 ( ± s , n=8)Table 4 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on colon weight/length, spleen index and CMDI score in UC rats ( ± s , n=8)

組別 劑量/(g·kg?1) 結腸質量/長度/(g·cm?1) 脾臟指數/% CMDI 評分 對照 — 0.12±0.01 0.18±0.04 0.25±0.46 模型 — 0.25±0.04## 0.32±0.04## 5.75±0.46## 黃連 2 0.14±0.01** 0.24±0.02** 2.25±0.46** 厚樸 2 0.15±0.02** 0.25±0.02** 2.38±0.52** 黃連-厚樸配伍 4 0.13±0.01** 0.24±0.04** 1.75±0.46** 柳氮磺胺吡啶 0.4 0.14±0.02** 0.25±0.02** 2.63±1.19**

2.2.3 黃連-厚樸配伍對UC大鼠結腸組織病理變化的影響 如圖6 所示，對照組大鼠結腸組織腺體排列整齊，組織結構完整，無充血、壞死和水腫等組織病理損傷變化；模型組大鼠結腸組織出現嚴重腸上皮損傷、隱窩萎縮或缺失，黏膜壞死，壞死區域原有組織結構消失，細胞水腫并伴有大量的炎性細胞浸潤；各給藥組大鼠結腸組織上皮損傷和炎性細胞浸潤減少，隱窩炎、組織水腫和壞死現象改善，其中黃連-厚樸配伍組大鼠結腸組織僅出現輕度的腸上皮損傷和少量炎性細胞浸潤。如表5 所示，與對照組比較，模型組大鼠組織病理損傷評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組組織病理損傷評分顯著降低（P＜0.01），尤其以黃連-厚樸配伍組最佳，提示黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸黏膜的保護作用優于單用黃連、厚樸。

圖6 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織病理變化的影響 (HE, ×100)Fig.6 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on colonic pathological changes in UC rats (HE, × 100)

表5 黃連-厚樸配伍對UC大鼠結腸組織病理損傷評分的影響 ( ± s , n=5)Table 5 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on pathological damage score of colon in UC rats ( ± s , n=5)

表5 黃連-厚樸配伍對UC大鼠結腸組織病理損傷評分的影響 ( ± s , n=5)Table 5 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on pathological damage score of colon in UC rats ( ± s , n=5)

組別 劑量/(g·kg?1) 組織病理損傷評分 對照 — 0.80±0.25 模型 — 5.80±0.12## 黃連 2 3.00±0.16** 厚樸 2 4.00±0.16** 黃連-厚樸配伍 4 2.80±0.25** 柳氮磺胺吡啶 0.4 2.90±0.29**

2.2.4 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達的影響 如圖7～9 和表6 所示，與對照組比較，模型組大鼠PI3K、Akt、cleaved Caspase-3 陽性表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠PI3K、Akt、cleaved Caspase-3 陽性表達顯著降低（P＜0.01）。

圖7 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織PI3K 表達的影響 (×400)Fig.7 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on PI3K expression in colon of UC rats (× 400)

2.2.5 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響 如圖10 和表 7 所示，與對照組比較，模型組大鼠p-Akt/Akt 和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠p-Akt/Akt 和cleaved Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。

3 討論

UC 是一種慢性非特異性炎性疾病[16]，主要病理特征為結腸黏膜的炎性反應[17]，其病因可能與遺傳、免疫、環境刺激等多種因素有關[18-20]。治療UC的主要藥物包括5-氨基水楊酸藥物、類固醇和免疫抑制劑等[21-22]，但長期使用不良反應大且費用昂貴，因此需要尋找新的治療策略。黃連-厚樸配伍源自《普濟方》中的“黃連厚樸湯”，方中僅有黃連、厚樸2 味藥，對胃腸道疾病具有確切的療效。本研究結果顯示，黃連、厚樸單獨或配伍使用均能夠顯著降低TNBS 誘導的UC 大鼠結腸質量/長度、CMDI評分、脾臟指數和組織病理評分，且黃連-厚樸配伍療效最佳。本研究結合基因組學和生物信息學分析方法，構建生物信息學和實驗藥理學的集成模型，從全基因組層面和網絡藥理學層面對藥物與疾病相互關系進行系統全面的分析[23]，從而闡明黃連-厚樸配伍對TNBS 誘導的UC 大鼠的作用機制。結果顯示，通過GEO 數據庫的基因表達譜數據篩選活動性UC 與健康人結腸組織之間的差異表達基因，共確定了794 個上調的差異表達基因和449 個下調的差異表達基因；KEGG 通路富集分析顯示，黃連-厚樸配伍主要通過作用于PPAR 信號通路、NF-κB信號通路和PI3K/Akt 信號通路治療UC。

圖8 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織Akt 表達的影響 (×400)Fig.8 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on Akt expression in colon of UC rats (× 400)

圖9 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織cleaved Caspase-3 表達的影響 (×400)Fig.9 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on cleaved Caspase-3 expression in colon of UC rats (× 400)

表6 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達的影響 ( ± s, n = 3)Table 6 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of PI3K, Akt and cleaved Caspase-3 in colon of UC rats ( ± s, n = 3)

表6 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織PI3K、Akt 和cleaved Caspase-3 表達的影響 ( ± s, n = 3)Table 6 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of PI3K, Akt and cleaved Caspase-3 in colon of UC rats ( ± s, n = 3)

組別 劑量/(g·kg?1) A 值 PI3K Akt cleaved Caspase-3 對照 — 1.13±0.80 2.21±0.16 0.54±0.05 模型 — 10.03±1.67## 7.77±0.68## 2.81±0.55## 黃連 2 4.13±0.98** 4.11±0.05** 1.61±0.18** 厚樸 2 5.00±0.53** 5.02±0.33** 2.10±0.10** 黃連-厚樸配伍 4 2.42±0.11** 3.09±0.40** 1.11±0.08** 柳氮磺胺吡啶 0.4 4.18±0.78** 4.13±1.09** 1.81±0.13**

圖10 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響Fig.10 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of p-Akt, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 proteins in colon of UC rats

表7 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響 ( ± s , n=6)Table 7 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of p-Akt, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 proteins in colon of UC rats ( ± s , n=6)

表7 黃連-厚樸配伍對UC 大鼠結腸組織p-Akt、Bcl-2 和cleaved Caspase-3 蛋白表達的影響 ( ± s , n=6)Table 7 Effect of Coptidis Rhizoma-Magnoliae Officinalis Cortex on expressions of p-Akt, Bcl-2 and cleaved Caspase-3 proteins in colon of UC rats ( ± s , n=6)

組別 劑量/(g·kg?1) 蛋白相對表達量 p-Akt/Akt Bcl-2/β-actin cleaved Caspase-3/β-actin 對照 — 0.21±0.08 7.63±1.66 0.23±0.12 模型 — 1.00±0## 1.00±0## 1.00±0## 黃連 2 0.46±0.19** 2.41±0.59** 0.28±0.07** 厚樸 2 0.54±0.22** 3.99±1.90** 0.26±0.13** 黃連-厚樸配伍 4 0.28±0.12** 7.38±2.23** 0.19±0.07** 柳氮磺胺吡啶 0.4 0.24±0.14** 4.79±1.84** 0.11±0.14**

炎性細胞因子的釋放和中性粒細胞的分泌是UC 的重要特征，常用于評估UC 的疾病活動[24]。促炎細胞因子如TNF-α、IL-6 和IL-1β 的分泌在UC的發展中起著重要作用[25]。本研究結果顯示，黃連、厚樸單用及配伍均能夠顯著抑制UC 大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和MPO 活性，且黃連-厚樸配伍療效最佳，表明黃連-厚樸配伍能夠抑制促炎細胞因子和相關炎性標志物的表達。細胞因子的釋放與PI3K/Akt 信號通路密切相關[26-27]。PI3K 由催化結構域P110 和調節結構域P85 組成，活化后進一步磷酸化Akt，從而發生信號轉導[28-30]。本研究結果顯示，黃連、厚樸單用及配伍能夠抑制大鼠結腸組織中PI3K、Akt 的陽性表達，并抑制p-Akt 蛋白表達水平。PI3K/AKT 參與細胞凋亡、自噬和增殖等多種生物學過程[31-32]。本研究結果顯示，黃連、厚樸單用及配伍能夠上調Bcl-2 蛋白表達水平，降低cleaved Caspase-3 蛋白表達水平，從而發揮抗凋亡作用。

綜上所述，本研究發現黃連、厚樸單用或配伍使用能夠通過抑制PI3K/Akt 信號通路，從而發揮對UC 大鼠的腸黏膜保護、抗炎和抗凋亡作用，其中黃連-厚樸配伍療效最佳，體現了中藥“相使”增效的配伍關系。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突