母鼠不同孕期巨細胞病毒感染對仔鼠發育及行為的影響

伍少瑩，李旭芳，施 全，劉 磊，蔣鳳菊

(廣州市婦女兒童醫療中心婦產科部，廣東廣州 510220)

人巨細胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)感染可引起腦炎、肝炎等器官功能受損[1]。亦可通過宮內感染或母乳喂養引起母嬰傳播[2]，對胎兒、嬰幼兒造成發育遲緩、智力障礙等危害[3]。目前，國內外研究極少關注HCMV感染對子代精神行為的影響。本研究擬通過建立小鼠動物模型，探討母代不同孕期CMV感染對子代精神行為的影響，為疾病診療提供臨床思路及實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

2017至2020年期間，選取北京維通利華純種動物室出生28天的BALB/c雌鼠36只(體重：10～12g/只)，國家級屏蔽環境內12/12h晝夜循環條件下自由進食飼養。

1.1.2小鼠巨細胞病毒

小鼠巨細胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)Smith毒株由華中科技大學附屬同濟醫院病毒實驗中心惠贈，在BALB/c雌鼠唾液腺組織中傳毒增殖并滴定出半數組織感染量(TCID50)后用于實驗。

1.1.3主要儀器

①曠場試驗儀：廣州飛康生物科技有限公司提供；黑色曠場箱尺寸：50cm×50cm×30cm。②Morris水迷宮試驗儀：上海移動信息科技有限公司產品；黑色圓桶：直徑150cm×高60cm。③懸尾試驗儀：上海欣軟信息科技有限公司產品；隔音避光箱尺寸：50cm×50cm×70cm。④蔗糖：太古糖業(中國)有限公司產品。

1.2方法

1.2.1 MCMV全身播散型感染模型的建立

小鼠腹腔內注射TCID50MCMV懸液(1.36×105PFU/mL)0.2mL，建立MCMV全身播散性感染模型。

1.2.2分組及干預方式

實驗小鼠隨機分為12組(A1，A2，A3，B1，B2，B3，C1，C2，C3，D1，D2，D3)，每組3只。

A為孕期再感染組，B為既往感染組，C為孕期原發感染組，D為正常對照組；1是孕早期(孕第5天)腹腔注射，2是孕中期(孕第10天)腹腔注射，3是孕晚期(孕第15天)腹腔注射。孕前，A、B組分別腹腔注射MCMV 0.2mL，C、D組分別腹腔注射0.9%無菌生理鹽水(sterile normal saline，NaCl)0.2mL。孕期，A、C組分別腹腔注射MCMV 0.2mL，B、D組分別腹腔注射0.9%NaCl 0.2mL。

1.2.3實驗過程

適應期后，雌鼠隨機進入不同實驗組，根據組別要求行第1次腹腔注射。1周后，小鼠按雌∶雄3∶1合籠24h，分籠后檢查雌鼠陰栓情況。有陰栓者單獨飼養并在不同孕期分別腹腔注射MCMV或0.9%NaCl 0.2mL，產仔后母、仔鼠同籠合養到產后21天。產后第22天，母、仔鼠分籠飼養，每組隨機抽取6只仔鼠進入實驗。仔鼠出生第1天(定為0周)，記錄出生體重，并記錄第3周(定為3周)及第6周(定為6周)的一般情況及行為學特征。第6周行為學試驗結束后，每組隨機處死仔鼠3只，測量腦臟器重量系數及唾液腺中MCMV表達水平。

1.2.4小鼠一般習性觀察

觀察并記錄小鼠體重(稱重3次后求均值作為當時體重)、毛發(稀疏、濃密)、食欲(每5天記錄1次飼料及水量的減少量)、活動(減少、增多、攻擊行為)、對刺激反應(遲鈍、活躍)。

1.2.5小鼠行為學試驗

①曠場試驗(open field test，OFT)記錄仔鼠放入曠場箱正中格后5min內行為變化，計算“水平運動總距離”和“直立運動次數”。仔鼠4只爪子進入1格記錄為水平運動，雙前爪騰空或攀附墻壁記錄為直立運動。②Morris水迷宮試驗(water maze test，WMT)第1～6天是空間學習記憶能力試驗，每天4次，同一時間開始，分次將仔鼠面向池壁，隨機從4個象限不同入水點放入水池，記錄仔鼠從入水到找出水下隱蔽平臺并站立其上所需時間，記錄“逃避潛伏時間”；第7天移掉平臺，做空間探索試驗，記錄60s內仔鼠“穿越原平臺位置次數”。③懸尾試驗(tail suspension test，TST)仔鼠頭部離地40cm向下懸掛，遠端尾部固定。試驗6min，觀察最后4min內仔鼠不動時間(指無晃動及掙扎的時間)，記錄“懸尾不動時間”。④糖水偏好試驗(sucrose preference test，SPT)訓練仔鼠適應飲糖水后開始試驗。禁食禁水24h后給等重的2瓶水(1瓶2%蔗糖水，1瓶純凈水)，8h交換1次瓶子位置，16h后取走2水瓶，計算“糖水偏好指數”[糖水偏好指數(%)=糖水攝入量(g)/[糖水消耗量(g)+純水消耗量(g)]×100%]。

1.2.6組織學評價

無菌分離被處死仔鼠的腦組織，計算腦臟器重量系數[臟器重量系數(%)=臟器重量/體重×100]。腦組織常規石蠟包埋、切片、HE染色、光鏡檢查病理損害情況。

1.2.7 Real time PCR法檢測MCMV定量

無菌分離被處死仔鼠的唾液腺，Real time PCR法測量組織中MCMV DNA定量。

1.3統計學方法

2結果

2.1各組仔鼠體重變化

每組6只。出生體重：A組、C組均低于D組(td值分別為2.42、3.34，P<0.05)。3周時體重：A3組、C1組、C2組、C3組均低于D組(td值分別為2.57、2.63、3.46、5.08，P<0.05)；C2組、C3組低于C1組(td值分別為2.98、3.05，P<0.05)。6周時體重：僅C3組低于D組(td=6.77，P<0.01)，提示C3組仔鼠發育持續滯后于正常組。實驗中，C2、C3組表現出不同程度的皮毛稀松、食欲差、活動少、對刺激反應遲鈍等。

2.2各組仔鼠唾液腺組織中MCMV定量

除D組外，其他組別唾液腺組織中均檢測出MCMV。其中，A、C組高于B組(td值分別為2.75、2.94，P<0.05)。說明母鼠有MCMV接觸史的仔鼠，都有MCMV感染情況，假如孕期有新接觸感染，仔鼠的病毒量會更高。

2.3各組仔鼠腦組織病理情況

2.3.1各組仔鼠腦臟器重量系數情況

腦臟器重量A1、C1組均高于D1組(td值分別為2.88、4.17，P<0.05)，且C1組高于A1組(td=3.06，P<0.05)；提示母鼠孕早期MCMV暴露對仔鼠腦組織有影響，母鼠孕早期原發感染的仔鼠受害更嚴重。B組與D組差異無統計學意義(td=0.46，P>0.05)，提示母鼠既往MCMV暴露對仔鼠腦組織影響很少。

2.3.2各組仔鼠腦組織病理情況

每組3只。B、D組仔鼠腦組織病理未見明顯異常。A1、C1組仔鼠腦組織病理見明顯異常情況，C1組較A1組嚴重。C1組仔鼠腦組織鏡下可見神經元細胞明顯水腫，排列紊亂擁擠，部分細胞變性壞死，細胞核消失，細胞核和細胞質內可見嗜酸性包涵體，間質水腫并淋巴細胞、單核細胞浸潤。(見圖1、圖2)

圖1 C1組(MCMV感染)仔鼠腦組織病理表現Fig.1 The pathological features of brain tissue of offspring mice in C1 group (with MCMV infection)

圖2 D1組(無MCMV感染)仔鼠腦組織病理表現Fig.2 The pathological features of brain tissue of offspring mice in D1 group (without MCMV infection)

2.4各組仔鼠的行為學試驗情況

3周時，與D組相比，A3、C1、C2和C3組仔鼠的水平運動總距離縮短(F值分別為11.4、9.03、10.95、19.04，P<0.05)，直立次數減少(F值分別為6.28、5.87、7.72、11.57，P<0.05)，懸尾不動時間延長(F值分別為9.14、13.37、14.45、23.26，P<0.05)，糖水偏好指數降低(F值分別為5.10、6.73、7.73、9.04，P<0.05)；A1、C1、C2和C3組仔鼠的逃避潛伏期時間延長(F值分別為19.22、28.02、21.77、23.43，P<0.05)，穿越原平臺位置次數減少(F值分別為22.10、26.87、20.56、27.32，P<0.05)。

6周時，與D組相比，C3組仔鼠的水平運動總距離縮短(F=23.44，P<0.05)，直立次數減少(F=16.25，P<0.05)，懸尾不動時間延長(F=14.03，P<0.05)，糖水偏好指數降低(F=9.98，P<0.05)，提示C3組仔鼠的快感缺失及退縮行為的提升由嬰幼期持續至成年期；A1、C1組仔鼠的逃避潛伏期時間延長(F值分別為15.33、23.78，P<0.05)，穿越原平臺位置次數減少(F值分別為14.12、22.21，P<0.05)，提示A1、C1組仔鼠的學習及記憶能力持續低于正常對照組。

表1 母鼠孕早期腹腔注射的各組仔鼠的情況Table 1 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the first

(續上表)

表2 母鼠孕中期腹腔注射的各組仔鼠的情況Table 2 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the second trimester

表3 母鼠孕晚期腹腔注射的各組仔鼠的情況Table 3 Situations of offspring mice in each group after maternal intraperitoneal injection in the third

3討論

3.1研究CMV感染者子代行為學表現有重要臨床意義

HCMV屬皰疹病毒β亞科，人群感染率高，我國孕婦HCMV抗體陽性率約95%[4]，兒童感染率為83.2%～87.3%[5]。由于HCMV有親神經特性，人孕期感染可導致胎兒腦積水、小頭畸形、嬰幼兒神經功能受損等情況[6]；目前無明確有效的孕期防治方案，先天感染的新生兒療效較差，嬰幼兒神經系統損傷難以逆轉。因此，本研究擬通過動物實驗來側面反映這類兒童在成長中可能存在的精神行為學變化特征及危害程度，為改進婦幼保健工作提供實驗依據。

3.2母代孕期MCMV感染直接影響子代出生體重

仔鼠出生體重結果顯示：A、C組均低于D組(P<0.05)，B組與D組差異無統計學意義(P>0.05)；提示母鼠單純既往感染(B組)對仔鼠出生體重影響不大，而孕期MCMV暴露(A組、C組)可對仔鼠出生體重產生一定影響，無論其是否有既往感染史。其原因可能是母鼠孕期免疫力低下，MCMV損害母鼠臟器功能直接影響妊娠結局[7]。

3.3母代孕期MCMV感染可能影響子代成年期體重

A組仔鼠體重變化顯示：A1、A2組3周時正常(P>0.05)；A3組3周時低于正常(P<0.05)，6周時正常(P>0.05)。提示孕早、中期MCMV再感染的母鼠體內可能存在一定的免疫功能，該功能削弱了MCMV對母鼠機體的損害，使A1、A2組母鼠身體有充裕的康復時間，產后可正常撫養仔鼠。而孕晚期MCMV再感染的A3組母鼠，可能產后身體未能立即康復，出現短期消極撫養行為，導致A3組仔鼠體重恢復慢于A1、A2組。預示不良撫養行為可能是影響子代體重增長的因素之一[8]。

C組仔鼠體重變化顯示：C1、C2組3周時低于正常(P<0.05)，6周時正常(P>0.05)；C3組3周及6周時均低于正常(P<0.05)。提示母鼠孕晚期原發感染(C3組)的仔鼠體重增長持續滯后。原因可能是母鼠孕期免疫低下，MCMV原發感染嚴重損害母鼠心、肝、腦等器官功能[7]，孕晚期原發感染的母鼠，身體未能康復就要接受分娩勞累及產后激素水平急劇變化的影響，還要承擔撫養后代重任，導致母鼠身心疲憊，出現持續不良情緒及消極撫養行為，致使C3組仔鼠體重持續滯后。而孕早、中期原發感染的母鼠(C1組、C2組)可能因為有更多的時間讓身體康復，得以在后期撫養過程中為仔鼠提供良性撫養，該良性支持有可能是C1、C2組仔鼠成年期體重恢復正常的原因[8]。

3.4母代體內的MCMV可通過多種途徑感染子代

仔鼠唾液腺組織MCMV檢測結果顯示：6周時，A、B、C組仔鼠均有MCMV感染。提示母鼠不同時期MCMV感染，都有可能通過宮內、分娩、母乳喂養或同伴生活等途徑感染仔鼠[9]。A、C組仔鼠的MCMV定量均高于B組，提示母鼠孕期MCMV暴露比既往感染的危害更大。

3.5孕早期MCMV暴露可影響子代一生的認知學習能力

WMT評估仔鼠學習記憶能力的結果顯示：3周時，A1、C1、C2、C3組仔鼠的能力均低于正常(P<0.05)；6周時，C2、C3組仔鼠的能力恢復正常(P>0.05)，而A1、C1組仔鼠的能力仍低于正常(P<0.05)。結合6周齡仔鼠腦組織病理情況：A1、C1組仔鼠腦組織明顯異常，揭示母鼠孕早期MCMV暴露可影響仔鼠一生的學習記憶能力。原因可能是孕早期缺乏胎盤屏障，MCMV感染母鼠后，在胎兒新生神經元細胞內高度聚集，損害仔鼠的腦功能，該不良影響持續至其成年[10]。而孕中、晚期MCMV暴露的C2、C3組仔鼠，有胎盤屏障保護，其不良影響僅在短期內表現：3周齡時認知學習能力下降，可能是受母鼠撫養期不良行為影響而出現的暫時現象，成年群居生活可改善該不良影響。

3.6子代嬰幼期的行為學特征受母代撫養行為影響

OFT、TST、SPT結果顯示：3周時，A3、C1、C2、C3組仔鼠有明顯退縮行為(P<0.05)。提示孕期有MCMV暴露的A、C組母鼠身體機能受MCMV損害，從而影響母鼠的撫養行為及質量，導致仔鼠嬰幼期的行為出現異常。

3.7子代成年期的行為學特征可能仍受母代不良撫養行為影響

OFT、TST、SPT結果顯示：6周時，僅C3組仔鼠有明顯退縮行為(P<0.05)。原因可能是C3組母鼠孕期初次感染MCMV，缺乏既往感染帶來的免疫保護(如A組或B組)，母鼠各器官功能受損更嚴重，加上孕晚期感染，身體尚未康復就要承受分娩勞累及產后激素變化的影響，使C3組母鼠身心疲憊，出現較長時間的不良情緒及消極撫養行為，甚至可能貫穿整個撫養期，對仔鼠精神及行為的影響更加深遠。這一發現與Jensen等[8]的研究報告相似，嬰幼兒期長期缺乏關愛與照顧，不僅會影響子代的身體健康狀態，而且會導致其出現與母代類似的不良情緒及行為；若考慮同組群體效應，情況可能更為嚴重。

綜上所述，CMV傳染性強，感染后可對宿主多器官造成不良影響，母代孕期感染可直接/間接影響子代身心健康成長。因此，建議女性在計劃懷孕前至少3個月內確認既往HCMV感染的康復情況，以保證身體可承受妊娠及產后撫養的相關重任。對于無既往感染史者，建議其在孕早期及孕晚期也進行HCMV的檢測，防治孕期原發感染的危害，保障母嬰身心健康。