Myostatin基因突變激發骨骼肌發育機制研究進展

高麗， 楊磊， 李光鵬*

1.包頭師范學院生物科學與技術學院，內蒙古包頭014030；2.內蒙古大學生命科學學院，省部共建草原家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，呼和浩特010030

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN），轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGFβ）超家族成員，是骨骼肌生長與發育的負調節因子，在不同物種中具有極強的進化保守性。MSTN基因突變通過促進肌纖維數量和肌纖維尺寸的增加導致肌肉肥大。肌肉質量是畜牧生產中重要的性狀，具有重要的經濟價值，因此MSTN基因受到了廣泛關注。

目前已經發現并通過基因編輯技術獲得了多種MSTN基因突變動物，包括牛[1-2]、綿羊[3]、狗[4]、豬[5]、山羊[6]和鳥類[7]等。在MSTN基因編輯動物中，僅對MSTN基因序列的小片段堿基進行刪除，不會影響其基因的結構完整性和動物基因組結構，卻可以使肌肉出現明顯的過度生長現象。因而，關于MSTN基因突變導致肌肉過度發育的作用機理成為研究熱點。本文將從成肌細胞增殖、分化、蛋白質合成分解代謝、組蛋白修飾以及巨噬細胞極化等5 個方面對MSTN突變促進肌肉發育的機理進行綜述，以期為農業動物育種新材料生產及重大惡病質的治療提供借鑒。

1 MSTN 基因突變通過調控細胞周期影響肌衛星細胞的增殖分化

骨骼肌中存在未分化的肌源性前體細胞——肌衛星細胞（muscle satellite cells，MSCs）[8]，骨骼肌的生長主要依賴于這一類細胞。在幼年生長時期，MSCs保持增殖狀態以增加生長的肌纖維中的細胞核，之后，隨著肌纖維直徑不斷增加，MSCs增殖速度逐漸減慢[9]。到成年時期，MSCs 保持靜止狀態，直到肌肉損傷誘導其活化[10]。研究表明，敲除MSTN會促進細胞增殖，而過表達MSTN會抑制細胞增殖和DNA 合成[9]。進一步的研究發現，MSTN基因突變可通過調控細胞周期進程，影響MSCs的增殖與分化過程，從而實現對肌肉發育的調控。通過RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術抑制C2C12 細胞中MSTN基因的表達，細胞周期顯著加快，其中，G0/G1期細胞減少，而S期細胞增加[11]。在本團隊的研究中得到了一致的結果，MSTN基因被敲除后，G1/S 期細胞比例減少，S 期和G2 期細胞增加，這一結果表明MSTN基因敲除可促進DNA 的合成，激發細胞增殖[12]。經過檢測細胞周期相關基因的表達情況，發現MSTN基因敲除可以下調抑制細胞周期的基因的表達，而上調細胞周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）的表達[13]。進一步研究其作用機理發現，MSTN基因上調通過增加其下游轉錄因子pSMAD3 與CDK 抑制因子p15、p16 和p27 的啟動子結合，來上調這些CDK 抑制因子的表達，進而抑制細胞周期進程[14]。同時，MSTN基因會通過 PI3K/AKT/GSK-3β 途徑降解周期蛋白D1，從而使細胞周期停滯[15]。由此可見，MSTN可通過影響細胞周期來影響肌肉發育。

2 MSTN 基因通過調節肌肉發育關鍵基因調控肌肉發育進程

在許多物種中，MSTN突變導致的肌肉異常發達現象是因MSTN突變而產生的肌纖維數量增多和體積增加共同作用的結果[3-4]。肌肉質量是動物生產中的重要指標，因此，為了制備肌肉發達的改良畜牧物種，研究人員在開發有效策略以阻斷MSTN的表達方面做了諸多努力與探索[6,16-17]。MSTN基因被激活后，會與其受體ActⅡB結合，使下游轉錄因子SMAD2/3 磷酸化，磷酸化的SMAD2/3 與 SMAD4 形成復合物[18]，隨后進入細胞核調控成肌發育關鍵基因的表達，進而抑制肌肉發育過程[19]。研究表明，MSTN過表達會通過下調肌肉發育關鍵基因MyoD和MyoG的mRNA 水平來抑制肌生成過程，從而阻斷成肌分化[20]。相反地，干擾內源性MSTN表達或MSTN突變會促進成肌分化過程[21-22]。MSTN基因突變的牛MSCs 成肌分化能力顯著增強，成肌關鍵因子MyoD、MyoG以及MYF5基因的表達顯著上調[21]；在豬中，通過CRISPR/Cas9技術制備的MSTN基因突變豬，其背最長肌中成肌分化關鍵基因MyoD、MyoG以及MYF5基因的表達顯著上調[22]。這些研究表明，MSTN基因突變改變了成肌關鍵因子的表達，從而影響成肌細胞分化及肌肉發育進程。

3 MSTN 基因通過調控蛋白質合成與降解調節肌肉發育

MSTN缺失導致的肌肉發達同樣被認為與蛋白質合成增加有關[23]。研究認為，MSTN敲除可能會促進胰島素樣生長因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）與其配體結合，從而激活PI3K/Akt信號通路，使 Akt 磷酸化；mTOR 是 Akt 下游的一個激酶，會使翻譯因子4E 結合蛋白1（4E binding protein 1，4E-BP1）和p70 核糖體蛋白S6 激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70s6k）磷酸化，從而誘導蛋白質的合成[24]。在體外培養的肌管中過表達MSTN基因會降低Akt 磷酸化程度，而抑制MSTN的表達則會促進Akt 磷酸化[25-26]。在小鼠中，MSTN的過表達同樣會降低Akt 以及其他Akt/mTOR 信號轉導成分（包括TSC2、核糖體蛋白S6和4E-BP1）的磷酸化[27]；而敲除MSTN，則會增加Akt 的磷酸化，促使 S6 和 S6 激酶 S6K 的表達[25,28]。此外，MSTN基因突變還可通過調控SMAD的磷酸化，激活Akt/mTOR 途徑[29]。在培養的日本比目魚肌肉細胞中，過表達MSTN基因同樣會導致Akt磷酸化程度降低，并顯著抑制mTOR和Akt/FoxO1信號通路，激活的Akt 誘導激活mTOR 信號通路，導致蛋白質合成增加[30]。同樣地，在本團隊前期的研究中，對MSTN基因突變牛骨骼肌進行轉錄組分析，結果顯示，差異表達基因顯著富集到了蛋白質及其磷酸化信號通路，且同樣富集到了PI3K-Akt 信號通路，表明MSTN敲除通過該信號通路影響蛋白質合成及其磷酸化，從而導致肌肉發達[12]。

肌肉質量是由蛋白質合成和蛋白質降解共同控制的。肌肉萎縮是蛋白質降解增加和蛋白質合成減少所致[31]。在蛋白質降解過程中，泛素蛋白酶體系統發揮重要作用[32]。MSTN基因被發現不僅僅影響蛋白質合成，同時對蛋白質降解具有重要的調控作用。研究表明，在日本比目魚肌肉細胞中過表達MSTN基因，會顯著上調泛素蛋白酶水解途徑的基因表達[30]，表明MSTN基因過表達會促進泛素蛋白水解酶體系對蛋白質的降解，從而抑制肌肉發育。在癌癥引起的惡病質肌細胞中，MSTN基因也被發現可以通過抑制蛋白質合成并激活泛素蛋白酶水解途徑和自噬-溶酶體途徑降解蛋白質，對肌肉萎縮起到雙重作用[32-33]。

4 MSTN 基因通過表觀修飾調控影響肌肉發育

4.1 表觀修飾與肌肉發育的關系

研究表明，表觀修飾（如DNA 甲基化、miRNA、LncRNA以及組蛋白的甲基化和乙酰化等）都對肌肉發育起著重要的調控作用。研究表明，在鴨胚的發育過程中，溫度會調控肌肉發育基因的表達，進而調控肌肉發育過程，而這一作用發生的機制就是通過影響肌肉發育基因的啟動子區甲基化實現的[34]。面肩肱型肌營養不良癥（facioscapulohumeral muscular dystrophy，FHSD）的發生是一些重復的衛星序列缺失致使肌肉發育的關鍵基因甲基化程度降低，從而導致基因表達失調，影響了肌肉發育過程[35-37]。這些研究均顯示，在肌肉發育過程中，涉及到一系列肌肉發育相關基因的甲基化與去甲基化導致的基因表達激活和抑制，表明DNA甲基化在肌肉發育過程中具有重要作用。

在組蛋白甲基化調控肌肉分化期間，活躍轉錄的基因被組蛋白H3 第4 位賴氨酸的三甲基化（histone H3 lysine 4 trimethylation，H3K4me3）標記，準備轉錄的基因被H3K4me2標記。組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase，HDAC）和SIRT 蛋白失活后，可以激活肌肉分化相關的轉錄因子，從而啟動肌肉分化程序[38]。研究人員對豬骨骼MSCs 和分化的肌管進行轉錄組和染色質免疫共沉淀測序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）技術分析，結果表明在分化的肌管中肌源性基因表達顯著上調，其組蛋白H3K27me3修飾顯著下降，且該修飾同時調控細胞增殖基因的表達[39]。

H3K27me3 可通過其與MyoG基因啟動子的結合抑制MyoG基因的表達，從而維持骨骼肌細胞的增殖。分化前C2C12 細胞基因組中總體H3K27me3 修飾水平顯著高于分化后細胞[40]。在小鼠早期胚胎的肌節中，通過高表達甲基化酶EZH2 和 H3K27me3 修飾來抑制MyoG基因的表達，從而抑制成肌細胞分化而促進其增殖[41]；綿羊成肌細胞中MSTN基因敲除后，甲基化酶EZH2的表達被上調，H3K27me3 修飾增強，從而抑制分化，促進肌細胞增殖[42]；在出生前后的綿羊骨骼肌基因組啟動子中，存在大量H3K27me3 修飾抑制基因的轉錄[43]。這些結果表明，H3K27me3修飾參與MSCs 的分化與增殖過程，從而調控肌肉發育過程。

4.2 MSTN 基因通過調控表觀修飾調節肌肉發育進程

研究表明，MSTN基因突變對DNA 甲基化修飾具有重要作用[21]。本團隊對MSTN突變和野生型牛肌肉組織進行轉錄組測序分析，研究發現富集到的GO 條目主要包括肌肉發育、成骨分化、細胞增殖分化與凋亡、蛋白質磷酸化以及基因表達的調控等[12]。更為重要的是，結果表明MSTN基因突變會影響DNA 甲基化相關酶類的表達。這些結果提示MSTN基因突變可能通過影響DNA甲基化修飾調控肌肉發育過程[12]。進一步研究發現，MSTN基因突變后成肌因子發生了顯著的去甲基化；MSTN基因突變后DNA 甲基轉移酶（DNA-methyltransferase，DNMT）表達下降，去甲基化酶——甲基胞嘧啶雙加氧酶（tet methylcytosine dioxygenase，TET）家族中TET1的表達顯著上調，且其上調程度大于DNMT 的下調程度[21]。這些結果表明MSTN基因突變可能通過上調去甲基化酶TET1的表達促使成肌因子發生去甲基化，從而上調成肌因子的表達水平。進一步通過ChIP 及雙熒光素酶報告試驗證明，MSTN基因下游的轉錄因子SMAD2/SMAD3 通過與去甲基化酶TET1 的啟動子結合而抑制其表達，從而調控TET1介導的去甲基化過程；當MSTN基因突變后，轉錄因子SMAD2/SMAD3對TET1的抑制作用減弱，TET1基因表達上調，使成肌因子發生去甲基化，從而促進成肌分化過程（圖1）[12]。

圖1 MSTN基因突變調控TET1介導的去甲基化作用機制[12]Fig.1 The possible mechanism of MSTN mutant regulated the TET1 mediated demethylation[12]

關于MSTN基因與組蛋白修飾之間的關聯性也有一些研究，研究人員發現敲除原代分離的綿羊成肌細胞中的MSTN基因，會導致H3K27me3的甲基化酶EZH2 的表達上調，并促進肌細胞的增殖過程[44]。在C2C12 成肌細胞向成脂細胞轉分化過程中，當MSTN基因的表達被敲減后，會通過調控組蛋白去甲基化酶JMJD3的表達來調控成脂基因的表達，從而調控成脂轉分化過程[45]。上述研究表明，MSTN基因突變可以通過影響表觀修飾調控肌肉發育過程。關于MSTN基因突變與miRNA、LncRNA、組蛋白乙?；刃揎椫g的相互作用尚未見報道，隨著進一步的研究可能會發現更多MSTN基因突變調控表觀修飾的證據。

5 MSTN 基因通過影響巨噬細胞極化促進損傷骨骼肌的修復再生

5.1 巨噬細胞極化在骨骼肌損傷修復中的作用

骨骼肌損傷是運動醫學中最常見的一種損傷，對損傷修復機理的研究以及損傷修復手段的探索是該領域的研究熱點[46]。骨骼肌中存在一類靜止的衛星細胞，當骨骼肌受到急性損傷時，這類靜止的衛星細胞便會被激活、增殖、分化，進而融合形成肌管，完成損傷肌肉的修復[47]。近年來研究表明，在骨骼肌損傷修復過程中，除MSCs 外，巨噬細胞的極化，即巨噬細胞對不同表型的獲取[48]同樣發揮重要作用[49]。在肌纖維損傷和再生過程中，巨噬細胞存在2 種亞型——具有促炎屬性的M1 型和抗炎屬性的M2 型[50-51]。在骨骼肌損傷后，促炎因子和趨化因子釋放招募骨髓源性單核細胞進入損傷區域，并成熟為巨噬細胞，之后，巨噬細胞極化為M1 型巨噬細胞，通過一氧化氮體系在肌肉損傷部位促使炎癥加重[52]，同時激活MSCs 使其大量增殖。隨后轉換為M2 型巨噬細胞，消除炎癥并介導組織再生和血管生成，促進受損骨骼肌成肌細胞分化融合，完成損傷修復[53]。

5.2 MSTN 基因與巨噬細胞源性因子之間的相互作用

關于MSTN基因在骨骼肌損傷修復中與巨噬細胞之間的相互作用，尚未見報道。但有許多研究已經表明，MSTN基因與巨噬細胞分泌的促進肌肉損傷修復的細胞因子之間存在重要相互作用。IGF1 是由巨噬細胞分泌的，是肌肉生長的一個主要的正調控因子[54]，與MSTN基因之間存在相互作用，在肌肉損傷修復中發揮重要功能。在正常條件下，IGF1信號會阻斷MSTN的通路；IGF1與其受體結合激活PI3K/Akt 信號通路，使Akt 磷酸化，使下游FoxO基因停留在細胞質中并抑制其表達。而MSTN基因可以通過抑制Akt 的磷酸化提高FoxO的活性，增強肌肉萎縮相關基因的表達。因此，IGF-1 與其受體結合后可以抑制FoxO的活性，抑制肌肉萎縮基因的表達[55]，從而促進肌肉發育。

在骨骼肌損傷修復中，炎性細胞因子發揮重要作用，且巨噬細胞是主要的炎性細胞。如白細胞介素IL-6 等因子會通過經典的NF-κB 以及Notch 信號通路參與骨骼肌損傷修復。TGF-β 信號通路與Notch 信號通路之間也存在相互作用，激活Notch 信號通路會抑制TGF-β 信號，下調MSTN的轉錄，從而導致肌肉增加[56]。

除 IGF1 和 Notch 信號通路外，MSTN基因與巨噬細胞分泌的肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）之間同樣具有相互調控作用。HGF 通過調控MSCs 的增殖、分化、遷移等功能參與骨骼肌再生[57]。HGF 對MSTN基因表達起負向調節作用，從而正向調控MSCs的激活[58]。這些研究表明，MSTN基因與巨噬細胞源性細胞因子之間具有重要的相互作用，而這些巨噬細胞源性因子都會通過影響巨噬細胞M1/M2 極化參與骨骼肌的修復損傷。上述結果提示，MSTN基因突變可能通過調控巨噬細胞M1/M2 極化來促進骨骼肌的損傷修復。對MSTN基因突變牛肌肉組織的轉錄組測序分析發現，差異表達基因最顯著富集的GO 條目是“調節免疫系統過程”“免疫系統過程”，同時也富集到了“細胞因子產生的調節”“巨噬細胞激活”等條目；在差異表達基因中，顯著富集到了巨噬細胞M1和M2極化相關的基因[12]。由此可以推測，MSTN基因突變對于巨噬細胞M1/M2 極化具有重要作用，MSTN基因突變可能通過調控巨噬細胞的極化促進肌肉發育，從而在骨骼肌損傷修復過程中發揮作用。

6 展望

自然界中存在許多MSTN自然突變導致肌肉肥大的動物[3-4]，MSTN基因在肌肉發育中起到的重要的調控作用，使其對于農業生產甚至疾病治療具有重要意義，基于此，研究人員通過基因編輯技術制備了許多人工編輯的MSTN動物突變[16-17]。隨著其作用機理研究的不斷深入，發現MSTN不僅調控肌肉發育，對于脂肪合成代謝[59]、糖代謝[11]以及骨骼發育[60]等生理過程都具有重要作用。對MSTN基因突變影響肌肉發育機理的深入揭示，對于農業動物產肉性能提升及重大疾病治療具有重要的指導意義。通過基因編輯技術制備的MSTN突變個體，不僅可以用作培育優良動物的育種材料，還可以將其作為肌肉萎縮及惡病質等疾病的藥物篩選模型，對于治療相關疾病具有重要作用。未來對于MSTN基因的研究也應著重探索MSTN控制肌肉發育與其他組織代謝通路之間的相互作用，以及MSTN基因引起的肌肉過度發育與組織微環境之間的關系，比如MSTN基因突變對巨噬細胞的影響等。只有把機體不同組織之間以及與組織微環境之間的相互關聯研究清楚后，才能夠更好的應用于動物生產與臨床實踐中。