水稻基因OsATS的克隆及功能鑒定

李曉旭 王 蕊 張利霞 宋亞萌 田曉楠 葛榮朝

研究簡報

水稻基因的克隆及功能鑒定

李曉旭**王 蕊**張利霞 宋亞萌 田曉楠 葛榮朝*

河北師范大學生命科學學院, 河北石家莊 050024

植物胚胎特異性蛋白ATS3和植物的滲透脅迫響應有密切關系, 本文對水稻基因的抗逆相關功能進行了初步研究。qRT-PCR檢測發現, 水稻在鹽脅迫后基因表達量顯著增加。構建基因過表達載體, 轉化擬南芥植株, 抗逆性檢測表明,基因的過表達可以顯著提高擬南芥在萌發階段和成株階段的耐鹽性。隨后將過表達載體p1300-35S:和RNA干涉載體pTCK303--RNAi轉入水稻, 抗逆性分析表明,過表達水稻株系在萌發階段和苗期的耐鹽性顯著提高, 而基因RNAi水稻株系耐鹽性則明顯下降。qRT-PCR和生理指標檢測表明,基因的表達可能通過調節、、基因的表達, 調控了水稻細胞中的脯氨酸、LEA蛋白質含量, 進而影響了水稻植株整體的耐鹽性。本研究初步揭示了基因的抗逆功能, 后續可通過調整該基因的表達量, 改良水稻的抗逆性。

水稻;基因; 過表達; RNAi干擾; 生理指標

水稻是我國乃至全世界重要的糧食作物之一[1], 水稻生產在國民經濟發展中發揮著巨大作用, 直接關系著國民生計[2]。水稻在谷類作物中對鹽分脅迫響應最為敏感, 鹽脅迫是導致水稻減產的重要原因之一, 是制約其生長發育和產量品質的一個重要環境因素[3]。目前土壤鹽漬化在全世界范圍嚴重影響著農業生產[4]。我國人口不斷增加, 而可耕地面積不斷減少, 這促使人們對鹽堿地的開發與利用產生了極大關注[5-6]。因此, 在我國農作物育種工作中選育耐鹽堿的優良品種顯得尤為重要。其中探究耐鹽相關基因及其耐鹽內在生理機制, 成為了耐鹽堿農作物選育的重要研究方向之一[4]。

生物脅迫和非生物脅迫是影響農作物生長、造成農業減產的重要原因, 植物在自身的生活周期中往往面臨著各種脅迫。在脅迫環境下, 植物通過調整特定的抗逆相關基因表達, 來提高自身對環境脅迫的適應能力。近年來, 水稻中已經鑒定了一系列抗逆相關基因, 這些基因的表達產物可以明顯影響植物對生物和非生物脅迫的耐受能力。高繼平等定位克隆到位于水稻第1染色體的耐鹽相關基因, 其編碼的Na+載體蛋白, 在Na+循環、離子長距離運輸中起重要作用。當水稻處于高鹽環境中時, SKC1蛋白能將過量的Na+集中轉運至水稻根部, 從而提高水稻耐鹽性[7-8]。彭靜靜等[9]研究發現水稻基因的過表達不僅能夠促進擬南芥種子萌發和根系生長, 而且在鹽脅迫下通過提高擬南芥內源抗氧化酶活性、降低膜脂過氧化程度, 增強了轉基因植株對一定程度鹽脅迫的耐受性。Liao等[10]研究表明水稻基因的過表達能夠使水稻和表達量上調, 提高水稻對高鹽脅迫的耐受性。另外研究發現, 水稻、、等基因均可通過不同的機制影響水稻的抗逆特性[11-15],和等轉錄因子基因則通過調控多種抗逆相關基因的表達從而提高水稻的抗逆性[16-20]。

胚胎發育晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant proteins, LEA)是在植物種子成熟后大量積累的一類親水蛋白[21]。研究表明, LEA家族基因廣泛參與植物生長發育、形態建成和衰老等生物學過程。在高鹽、干旱等非生物脅迫下, LEA蛋白還能夠對植株起到關鍵的保護作用[22-24]。水稻基因()與辣椒抗逆基因序列有一定同源性, 具有胚胎特異性蛋白ATS3保守結構域和脂氧合酶2基因家族保守域[25]。研究表明, 植物胚胎特異性蛋白ATS3也是在成熟種子大量表達的一種蛋白, 和植物的滲透脅迫響應有密切關系[26]。本文擬通過對基因在水稻中進行過量表達及RNA干涉, 從而對其抗逆功能和相關機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試品種為日本晴水稻(L.cv. Nipponbare)、Columbia型擬南芥, 真核表達載體采用pCAMBIA1300 (簡稱p1300), 植物轉化采用GV3101、EHA105型根癌農桿菌, 總RNA提取試劑TRNzol、逆轉錄試劑盒、酶、限制性內切酶和T4連接酶等, 購自Takara Bio生物技術有限公司, 常用試劑均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽脅迫后基因的表達模式 將培養14 d的水稻幼苗在140 mmol L–1NaCl溶液中處理0、1、6和12 h后, 剪取葉片, 提取總RNA, 反轉錄獲得cDNA, 利用P1: 5'-CTGTCAACGACGGTTTCCAAG-3'、P2: 5'- GCATCGTGACCTTGGTGTAC-3', 以基因作為內參, 對不同處理的cDNA進行qRT-PCR檢測, 重復檢測3次, 確定基因在鹽脅迫后的表達模式。

1.2.2 目的基因的克隆及載體構建 提取日本晴水稻幼苗葉片總RNA, 反轉錄獲得cDNA, 利用高保真DNA聚合酶Prime Star對目的基因進行PCR擴增, 引物采用RP: 5'-CCTCGCCATCTCCTCAGCCAT-3' (I, 下畫線為酶切位點, 下同)和LP: 5'-CCGACGTCGCAAACCATCACTG-3' (I)。擴增產物回收后連接到pMD18-T載體。基因測序正確后, 酶切p1300和pMD18-T-質粒, 回收、連接獲得過表達載體p1300-35S:, 轉入根癌農桿菌EHA105、GV3101備用。

以pMD18-T-質粒為模板, 用引物RNAiRP: 5'-CAGTGGGTCAGGGTCTAC-3' (I、I)和RNAiLP: 5'-CCAGATCAG AATCAGAATCTGATCTG-3' (IH I), PCR擴增后連接到pMD18-T, 獲得陽性克隆pMD18-T-- RNAi。基因測序后酶切pTCK303和pMD18-T-- RNAi質粒, 首先采用內側酶I/I進行雙酶切, 電泳、回收、連接、轉化到大腸桿菌, 獲得正連載體pTCK303--RNAi-sense。之后提取pTCK303-- RNAi-sense和pMD18-T--RNAi質粒, 采用外側酶I/H I進行雙酶切, 構建RNAi載體pTCK303--RNAi, 轉入根癌農桿菌EHA105備用。

以pMD18-T-質粒為模板, PCR擴增構建pMD18-T--GFP, 測序準確后進行酶切、回收、連接獲得亞細胞定位載體p2300--GFP4, 轉入根癌農桿菌GV3101備用。

1.2.3 OsATS蛋白質的亞細胞定位 培養含有p2300--GFP4質粒的農桿菌GV3101, 制備浸染液, 通過注射器將農桿菌液注入到煙草葉片內, 做好標記, 在40~48 h之間, 通過激光共聚焦顯微鏡觀察OsATS的亞細胞定位情況。

1.2.4基因過表達擬南芥的獲得和抗逆性分析 培養含有p1300-35S:的農桿菌GV3101, 利用浸花法轉化擬南芥。取基因過表達純合體擬南芥和野生型擬南芥種子4℃春化3 d后, 分別消毒、播種于含150 mmol L–1NaCl、200 mmol L–1NaCl的MS培養基上, 正常光照培養3~4 d, 統計萌發率。為檢測轉基因擬南芥成株的耐鹽性, 將培養14 d剛剛抽薹的基因過表達和野生型擬南芥每隔4 d澆灌200 mmol L–1NaCl進行脅迫處理, 連續處理15 d。

1.2.5 水稻愈傷組織的遺傳轉化及抗逆性檢測 利用水稻種子誘導愈傷組織, 利用含有p1300-35S:、pTCK303--RNAi的EHA105農桿菌共培養轉化獲得基因過表達水稻和RNAi轉基因水稻。用含50 mg L–1潮霉素的水浸泡轉基因水稻種子至萌發。9 d后選取生根發芽的抗性株系, 分別移栽入微孔板中, Hoagland營養液培養7 d, 然后分別轉入含140 mmol L–1NaCl的Hoagland營養液中處理4~10 d, 恢復培養5 d, 觀察表型變化。

1.2.6 轉基因水稻的生理指標檢測 分別用含有清水和140 mmol L–1NaCl溶液培養野生型和轉基因水稻5 d,測定其脯氨酸含量、MDA含量。同時選取鹽脅迫后、葉齡相似的野生型水稻與轉基因水稻的葉片, 剪成小塊, 稱取0.2 g, 將葉片壓入10 mL蒸餾水中, 真空抽氣1 h后重新充入空氣。將樣品置于室溫攪動浸提1 h后, 用電導儀測定樣品的處理電導率。再將同樣的葉片樣品放入100℃沸水浴15 min, 轉入清水中冷卻10 min, 測定其煮沸電導率。電導率公式為: 相對電導率(%) ＝ (處理電導率-空白電導率) / (煮沸電導率-空白電導率)×100。

1.2.7基因過量表達水稻中相關基因表達量的檢測 利用總RNA提取試劑盒提取水稻總RNA, 反轉錄獲得cDNA, 以水稻基因(AK071586)為內參, 對水稻脯氨酸脫氫酶基因(proline dehydrogenase, AK121010)、吡咯啉-5-羧酸合酶基因(δ-1-pyrroline-5-carboxylate synthase 1, AK101985)、晚期胚胎發生豐富蛋白基因(late embryogenesis abundant protein, AK063984)進行熒光定量PCR檢測, 每個樣本3次重復, PCR在ABI 7300儀器上進行?

差異顯著性分析采用-test 方法, *< 0.05、**< 0.01。

The significant difference is evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01.

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫后OsATS基因在水稻中的表達模式

對鹽脅迫處理的日本晴水稻幼苗進行qRT-PCR檢測結果表明, 在水稻受到140 mmol L–1NaCl脅迫后,基因表達量會出現顯著增加, 1 h后即上升到脅迫處理前的3倍左右。此后, 在鹽脅迫處理6 h和12 h時, 其表達量均維持在較高水平(圖1)。

2.2 OsATS蛋白的亞細胞定位

利用煙草葉片對OsATS蛋白進行亞細胞定位結果顯示, 對照試驗中注射含有p2300-GFP質粒菌株的煙草葉片在細胞核、細胞質和細胞膜均有綠色熒光, 而注射含有p2300--GFP質粒菌株的煙草葉片只在細胞核有綠色熒光(圖2), 說明OsATS蛋白在細胞中主要定位于細胞核。

2.3 OsATS基因的克隆與轉基因擬南芥的獲得

以日本晴水稻cDNA為模板擴增獲得長度為624 bp的基因序列, 構建過表達載體p1300-35S:。利用含有p1300-35S:質粒的農桿菌GV3101通過浸花法轉化擬南芥, 在含有潮霉素的MS培養基上逐代篩選獲得陽性純合體轉基因擬南芥。對獲得的35S:轉基因擬南芥提取葉片DNA進行PCR擴增檢測, 過表達植株OX-1、OX-4和OX-5轉基因擬南芥均擴增獲得了624 bp的特異條帶, 確定外源基因成功插入到3個轉基因擬南芥株系的基因組之中(圖3)。對3個過表達擬南芥株系cDNA進行qRT-PCR檢測實驗中, 由于野生型擬南芥沒有, 因此只能對qRT-PCR檢測獲得的ΔCt進行比較(ΔCt值為樣本Ct值根據內參基因Ct值調整后的數值), 最終確認過表達擬南芥株系OX-1、OX-4、OX-5中基因均獲得了高水平的表達, OX-5株系中基因的表達量最高(圖4)。

2.4 OsATS轉基因擬南芥的抗逆性分析

將過表達擬南芥的3個純合體株系種子消毒后接種到含有150 mmol L–1和200 mmol L–1NaCl的MS培養基, 對其種子萌發階段的耐鹽性檢測結果表明, 在2種濃度的鹽脅迫下, 過表達擬南芥萌發率都顯著高于野生型, 其中OX-5株系在萌發階段的耐鹽性提高更加明顯, 尤其是對200 mmol L–1NaCl的耐受性提高較另外2個株系更加明顯(圖5)。

將培養14 d的Columbia野生型擬南芥、過表達擬南芥成株進行200 mmol L–1NaCl鹽脅迫處理, 結果表明, 高鹽溶液脅迫15 d后, 野生型擬南芥葉片明顯枯黃, 植株瘦弱矮小, 而3個過表達擬南芥株系葉片, 均呈墨綠色, 可以正常抽薹、開花結實, 果莢數目明顯比野生型較多(圖6)。因此,基因的過表達明顯提高了擬南芥成株對鹽脅迫的耐受性。

差異顯著性分析采用-test方法, ***<0.001。

The significant difference is evaluated by the Student’s-test. ***< 0.001.

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01。

The significant difference is evaluated by the Student's-test. *< 0.05, **< 0.01.

2.5 轉基因水稻的獲得及其抗逆性鑒定

利用含有pTCK303--RNAi或p1300-35S:載體的農桿菌, 分別對水稻愈傷組織進行浸染, 分化培養后獲得基因過表達水稻和RNAi水稻。通過對基因過表達株系、RNAi株系和野生型水稻幼苗進行熒光定量PCR檢測表明, 過表達轉基因水稻OX-3、OX-4和OX-9株系中基因的表達量顯著增高, 而RNAi轉基因水稻株系、和的基因表達量則顯著下降(圖7)。

WT: 野生型水稻; OX:過表達轉基因水稻株系;: RNAi轉基因水稻株系; 差異顯著性分析采用-test方法, ***< 0.001。

WT: wild type rice; OX:overexpression transgenic rice lines;: RNAi transgenic rice lines; The significant difference is evaluated by the Student’s-test. ***< 0.001.

對過表達水稻的3個純合體株系OX-3、OX-4、OX-9和RNAi轉基因水稻株系、、在種子萌發階段的耐鹽性進行檢測, 結果表明, 在140 mmol L–1NaCl脅迫下,過表達水稻萌發速度比野生型水稻要快,RNAi水稻種子的萌發則相對緩慢, 且第5天其萌發率平均僅達到87.9%, 而此時過表達水稻與野生型水稻種子均全部萌發(圖8)。

對生長狀態一致的日本晴野生水稻植株、p1300- 35S:轉基因株系OX-3、OX-4、OX-9和RNAi轉基因水稻株系、、用140 mmol L–1NaCl溶液進行脅迫培養,過表達轉基因株系和野生型水稻脅迫6 d、恢復5 d后葉片均出現枯萎變黃的現象, 但過表達轉基因植株的長勢明顯強于日本晴植株, OX-3、OX-4、OX-9株系的綠葉率分別為21.3%、17.3%、23.3%, 而野生型水稻綠葉率僅為6%, 說明基因的過量表達可以顯著提高水稻植株的耐鹽性(圖9)。RNAi轉基因株系和野生型水稻鹽脅迫處理4 d、恢復5 d后同樣均有葉片枯萎的現象, 但是RNAi轉基因株系相對萎蔫更為嚴重,、、株系的綠葉率分別為4.0%、6.7%、3.3%, 相對于野生型水稻20%的綠葉率, 水稻基因表達被干涉后其耐鹽性顯著降低(圖9)。

2.6 OsATS轉基因水稻的生理檢測

將野生型水稻、過表達水稻和RNAi轉基因水稻幼苗用140 mmol L–1NaCl處理5 d后, 分別對其葉片的脯氨酸含量、丙二醛含量和細胞質膜透性進行檢測, 結果表明,過表達水稻的脯氨酸含量的增加量顯著高于野生型, RNAi株系的脯氨酸在鹽脅迫前后較野生型水稻的含量均明顯較低。丙二醛含量檢測結果表明,過表達水稻鹽脅迫后的丙二醛含量明顯低于野生型水稻, RNAi株系在鹽脅迫后丙二醛含量則明顯較高。鹽脅迫后,過表達水稻的細胞質膜透性明顯低于野生型水稻, 而RNAi轉基因水稻的細胞質膜透性則顯著高于野生型水稻(圖10)。

2.7 OsATS基因表達對水稻抗逆相關基因表達的影響

對基因過表達水稻株系OX-3和RNAi水稻株系進行140 mmol L–1NaCl處理前后的、、等抗逆相關基因表達量進行qRT-PCR檢測結果表明,基因過表達水稻在鹽脅迫前后、基因的表達量顯著較高。基因RNAi水稻中的表達量在鹽脅迫前明顯較高, 在鹽脅迫后, RNAi水稻中的表達量更是極顯著高于對照水稻和基因過表達水稻(圖11)。

A: 脯氨酸含量; B: 丙二醛含量; C: 細胞質膜透性。差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***<0.001。

A: proline content; B: MDA content; C: relative electrolyte leakage; The significant difference is evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

3 討論

OsATS蛋白具有高度同源的植物胚胎特異性蛋白ATS3保守結構域, 可能與水稻抵御生物和非生物脅迫的功能密切相關, 我們對基因通過煙草花葉病毒CAMV 35S啟動子實現過量表達或通過RNAi進行干涉表達, 以期確定該基因對水稻耐鹽性的影響。首先,基因在擬南芥中的過表達明顯提高了轉基因擬南芥在鹽脅迫下的萌發率, 使過表達擬南芥表現出更好的耐鹽性。隨后, 通過對基因過表達水稻和RNAi水稻進行抗逆性檢測, 表明無論是在萌發階段還是在幼苗生長階段,基因過表達水稻表現出更好的耐鹽性, 而RNAi水稻則表現出明顯的敏鹽特點。生理指標的檢測表明, 在鹽脅迫前后基因過表達水稻細胞中都具有更高的脯氨酸含量,基因RNAi水稻細胞中的水稻脯氨酸含量則明顯較低。脯氨酸作為細胞中一種重要的氨基酸小分子, 對細胞眾多代謝過程有著至關重要的影響[27]。在植物遭受鹽、旱等非生物脅迫時, 脯氨酸在細胞溶質中能維持穩定的滲透壓, 同時可以高效清除胞內由于脅迫產生的大量活性氧, 維持細胞穩態[28]。另外2項的生理指標檢測表明,基因過表達水稻在鹽脅迫后胞內丙二醛含量明顯較低, 細胞質膜透性也比野生型水稻要低, 表明過量表達的OsATS蛋白質使得水稻植株細胞在鹽脅迫后受損明顯減輕。而基因RNAi水稻植株中丙二醛、細胞質膜透性兩項指標相對于野生型水稻明顯要高,基因表達量的下降造成水稻細胞受到了更明顯的鹽脅迫損傷。

亞細胞定位檢測發現OsATS蛋白明顯位于細胞核, 但分析發現其并不具備轉錄因子的相關特征序列, 因此推測OsATS有可能通過間接調控的方式影響到了其他抗逆相關基因的表達。通過對相關基因的定量PCR檢測,基因表達量的變化明顯影響了3個水稻基因、、的表達。OsP5CS是一種位于水稻細胞溶質之中、具有谷氨酸激酶(GK)和C-谷氨酰磷酸還原酶(GPR)活性的雙功能酶, 是脯氨酸合成途徑中重要的限速酶, P5CS表達量的增加可明顯提高胞內脯氨酸的大量積累[29]?胚胎發育晚期富集蛋白LEA3則可作為滲透調節物質, 維持細胞膨壓, 減輕水分脅迫對植物造成的損傷, 與植物的抗逆性密切相關[30]。脯氨酸脫氫酶PDH屬于脯氨酸代謝途徑的重要蛋白酶, PDH與細胞中活性氧ROS的形成密切相關。胞內大量ROS的生成則對細胞造成損傷, 促進細胞凋亡[31]。定量PCR檢測表明基因過量表達會造成表達量上升, 這應該是過表達水稻胞內脯氨酸積累的主要原因之一。另外,基因過表達水稻還通過基因的表達增強, 更有效的解除了鹽脅迫造成的活性氧增高損傷。相對而言,基因RNAi植株、基因表達的受抑, 減弱了滲透脅迫保護物質脯氨酸、LEA蛋白質的積累。同時,基因RNAi水稻中基因的更強表達使得細胞產生了更多的活性氧物質, 從而降低了轉基因水稻的耐鹽性。

差異顯著性分析采用-test方法, *< 0.05、**< 0.01、***< 0.001。

The significant difference is evaluated by the Student’s-test. *< 0.05, **< 0.01, ***< 0.001.

當然, 本研究只是初步揭示了基因對水稻耐鹽性的影響及其部分的內在機理, 至于該基因的表達對水稻在干旱等其他逆境脅迫下的抗逆性影響, 以及該基因涉及的具體信號傳導通路還有待進行進一步深入研究。

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Cloning and functional identification of genein rice

LI Xiao-Xu**, WANG Rui**, ZHANG Li-Xia, SONG Ya-Meng, TIAN Xiao-Nan, and GE Rong-Chao*

College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China

The plant embryo specific protein ATS3 is closely related to osmotic stress response in plants. Here, the stress resistance related genewas preliminarily studied in rice. Fluorescence quantitative PCR showed that the relative expression level ofincreased significantly after salt stress in rice. The overexpression vector ofwas constructed and transformed into. The stress resistance test revealed that the overexpression ofgene could significantly improve the salt tolerance ofat germination and adult stages. After that, the overexpression vector p1300-35s:and RNA interference vector pTCK303-RNAi were transferred into rice. The stress tolerance analysis indicated that the salt tolerance ofoverexpression rice lines significantly increased at germination stage and seedling stage, while the salt tolerance ofRNAi rice lines significantly decreased. Results of qRT-PCR and physiological index detection demonstrated that the relative expression levels ofgene might regulate the protein content of proline and LEA cells by regulating the expression of,and, thus affecting the salt tolerance in rice. This study preliminarily revealed the stress resistance function ofgene, which laid a foundation for improving rice stress resistance by adjusting the relative expression level ofgene.

rice;genes; overexpression; RNA interference; physiological indexes

10.3724/SP.J.1006.2021.02079

本研究由國家自然科學基金項目(30900104)和河北省自然科學基金項目(C2016205158)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (30900104) and the Natural Science Foundation of Hebei Province (C2016205158).

葛榮朝, E-mail: grcgp@sina.com

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

李曉旭, E-mail: jiandanxiaoxiao@163.com; 王蕊, E-mail: 1915435558@qq.com

2020-11-21;

2021-03-22;

2021-04-07.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210407.1627.006.html