探討極長鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥新生兒的臨床特征、基因變異及其基因型—表型的關系

高 靜 劉曉景 陳永興 楊海花 衛海燕

鄭州大學附屬兒童醫院 河南省兒童醫院 鄭州兒童醫院內分泌遺傳代謝科，河南省鄭州市 450007

VLCADD屬于臨床較為罕見的脂肪酸代謝障礙性疾病，主要患病群體為嬰幼兒，屬于常染色體隱性遺傳，經流行性病學調查研究發現，該疾病發病率在歐美國家中占1/85 000。ACADVL基因(OMIM609575)是該疾病的主要編碼基因，屬于VLCAD家族，其參與脂肪酸B氧化的部位為線粒體上。疾病主要類型為遲發型、嬰兒型以及新生兒早發型。其中由感染、運動、運動不耐受以及肌無力導致的橫紋肌溶解為遲發型的主要表現；肌無力、肝大以及低酮性低血糖為嬰兒型的主要表現；Reye綜合征、腦病、心肌病為新生兒早發型的主要表現[1]。經國外臨床研究發現，該疾病的臨床特異性診斷指標為十四酰基肉堿(C14：1)增加，故對該疾病的主要診斷方式為應用串聯質譜技術對血酰基肉堿譜檢測，但國內對該項研究仍較少。故本研究特選取近六年在河南省兒童醫院收治的7例該疾病患者的尿有機酸、血酰基肉堿譜、實驗室檢查以及臨床特點進行分析，探究該疾病的基因型與表型的相關性、實驗室檢查特點以及臨床表現。報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 7例患兒均來自7個不同家庭，年齡2d～14歲，男4例、女3例，父母均非近親婚配。診斷主要依靠ACADVL基因突變分析、尿氣相質譜有機酸分析(GC-MS)及血串聯質譜分析(LC-MS/MS)綜合分析。所有檢測的知情同意書均已被患兒及其家屬簽署。

1.2 方法 (1)所有患兒接受氣相色譜質譜、串聯質譜和尿常規、血碳酸氫根/陰離子間隙、血乳酸、血氨、肌酸激酶、丙氨酸轉氨酶、天冬氨酸轉氨酶、血糖等常規實驗室檢查。給予所有患兒進行飲食干預，飲食應為低脂高碳水化合物[2]。并接受避免空腹、左旋肉堿以及補充中鏈甘油三酯等治療。對患兒的尿氣相質譜、血串聯質譜以及各項生化指標定期隨訪復查。(2)接受氣相色譜法尿有機酸以及酰基肉堿的串聯質譜檢測。于專用濾紙中加入患兒剛入院時采取的全血，對濾紙紙片中酰基肉堿的水平應用串聯質譜(ABSciex，API 4000)檢測[3]。并應用日本島津有限公司生產的QP2010氣相色譜對患兒的尿液中的有機酸的水平進行監測。(3)基因突變分析：抽取患兒父母以及患兒的外周血白細胞，應用天根生物有限公司生產的TIANamp血液DNA提取試劑盒將其DNA進行提取。該疾病的基因中有22個外顯子，通過Primer Premier 5.0軟件對引物進行設計。于滅菌雙蒸水中加入1.25U DreamTaqDNA聚合酶、5μl 10×DreamTaqDNA聚合酶緩沖液、1μl 10μmol/L的引物、10nmol/L的dNTPs 1μl以及200ng的基因組DNA至50μl進行擴增反應，且所有試劑的生產公司均為Fermentas公司[4]。PCR反應條件：先進行1min的95℃預變性，進行30s 95℃變性。再給予30s 54～68℃退火。在給予40s的72℃延伸，總循環為32次。再給予10min的72℃延伸。純化后，應用上海華大基因公司生產的AB1377測序儀對患者的DNA進行測定，并對比GenBank人類ACADVL基因，通過DNA雙向測序進行突變外顯子片段的證實[5]。并應用直接測序法對新錯義突變進行鑒定，并對比50例健康人，將基因多態性排除。

2 結果

2.1 血酰基肉堿譜結果分析 7例患兒均有血十四烯酰基肉堿(C14：1)明顯升高,可伴有C10降低，C14、C14:2、C16等升高。見表1。

表1 血酰基肉堿譜結果分析(μmol/L)

2.2 基因型與表型的相關性、實驗室檢查特點以及臨床表現分析 尿氣相質譜有機酸分析可發現二羧酸尿。4例為心肌病型，2例為肝型，1例為肌病型。其中3例心肌病型早期死亡，目前存活的1例心肌病型患兒是通過新生兒疾病篩查得以早期診斷和治療。7例患兒ACADVL基因突變分析示不同位點均可出現突變，以錯義突變為主，ACADVL基因突變譜高度異質。見表2。

表2 基因型與表型的相關性、實驗室檢查特點以及臨床表現分析

3 討論

隨著氣相質譜以及串聯質譜技術的發展，遺傳代謝性疾病的診斷率得以提高。但VLCADD疾病的檢出在我國報道仍較少，這與該疾病在亞洲地區患病率較低有關，但該疾病的死亡率極高，只有通過早期診斷并給予及時有效的治療保障患兒的生命安全。現本研究特通過對該疾病患兒的治療、診斷、臨床表現以及基因特點進行分析，對患兒的疾病特點進行探究，以找出確診疾病的有效途徑。

本研究表明，7例患兒均有血十四烯酰基肉堿(C14：1)明顯升高,可伴有C10降低，C14、C14:2、C16等升高。這與只有當游離肉堿與C14-C18酰基輔酶A相結合后，才可將C14-C18從線粒體內脫離，而該疾病患者的組織中游離肉堿含量減少有關。本研究通過尿氣相質譜有機酸分析診斷出伴有二羧酸尿癥，但如患兒伴有橫紋肌溶解或癥狀較輕，則不伴有二羧酸尿癥，故以C14：1明顯升高可作為該疾病的特

異性診斷指標。但同時經多項檢查發現，本研究中的7例患兒的實驗室檢查結果、臨床表現以及發病年齡均不相同，故不能通過C14：1升高程度判斷患病嚴重程度。

本研究表明，7例患兒中4例為心肌病型，2例為肝型，1例為肌病型。其中3例心肌病型早期死亡，目前存活的1例心肌病型患兒是通過新生兒疾病篩查得以早期診斷和治療。7例患兒ACADVL基因突變分析示不同位點均可出現突變，以錯義突變為主，ACADVL基因突變譜高度異質。在不同種屬中，該疾病蛋白的氨基酸位點多為高度保守點，故當其發生突變后，致病率較高。且通過軟件將此類突變與其對應的野生型氨基酸的電荷特性、疏水性、功能、大小進行模型構建發現，突變直接改變了蛋白的二級結構，進而導致VLCAD蛋白與其他分子間的作用以及氫鍵的形成受到影響，進而導致疾病發生[6]。

綜上所述，需通過基因診斷、實驗室檢查以及臨床癥狀等多項檢查對ACADVL疾病進行診斷，以期通過早期診斷改善患兒預后。