胰島素瘤相關差異表達基因的生物信息學分析

高志壕

四川省巴中市中醫院檢驗科 636600

胰島素瘤是最常見的功能性胰腺神經內分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasia,pNEN)，起源于胰島β細胞，表現為大量胰島素陣發性分泌導致低血糖反復發作，根據典型whipple三聯征(反復發作的低血糖癥狀、發作時血糖<2.8mmol/L、供糖后癥狀迅速緩解)聯合激素水平測定診斷并不難。但胰島素瘤患者常伴發精神失常、癲癇發作、意識障礙等中樞神經精神癥狀甚至以此為首發、主要表現，此種患者不僅極易誤診為癲癇、癔癥、腦血管病等其他疾病[1]，長期的高胰島素、低血糖狀態還會導致智力低下甚至不可逆癡呆[2]，嚴重影響生活質量。目前胰島素瘤的主流治療手段是外科手術，大部分胰島素瘤都是良性腫瘤，但其幾乎都有惡變潛能，故而早期發現、治療是非常重要的。胰島素瘤的病因及發病機制仍不清楚，推測可能是一個復雜多基因疾病。近年來隨著基因芯片及高通量測序等現代生物技術的蓬勃發展，利用生物信息學分析大數據可以從理論上初步揭示許多腫瘤發生發展分子機制。本研究選擇GEO數據庫中的胰島素瘤相關基因表達譜芯片數據集，依托生物信息學探討胰島素瘤分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源 以“insulinoma”為關鍵詞，物種限定為“homo sapiens”,研究類型選擇“expression profiling by array”，在基因表達綜合數據庫(Gene Expression Omnibus,GEO， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫檢索，得到由Anguraj Sadanandam等在2016年1月更新的數據集GSE73338。該數據集來源于英國倫敦癌癥研究所，采用18.5K human oligo microarrays obtained from the Ohio State University Cancer Center平臺，內含97個數據樣本，其中17個胰島素瘤組織、4個正常胰島組織、63個非功能性神經內分泌腫瘤組織、5個正常胰腺組織、7個已轉移的胰腺神經內分泌腫瘤組織、1個未明確分類的功能性胰腺神經內分泌腫瘤組織，剔除非功能性胰腺神經內分泌腫瘤等組別資料，僅分析17例胰島素瘤及4例正常胰島對照組織數據。該數據集共包含15 961個基因的表達數據。

1.2 差異表達基因的篩選 利用GEO數據庫自帶數據分析工具GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)比較胰島素瘤患者組與正常胰島組織基因表達，下載原始數據后按照adj.P.value<0.01 且差異倍數(Fold change,FC)≥4的標準篩選差異表達基因(Differentially expressed genes,DEGs)，并繪制火山圖分析差異基因分布。

1.3 基因本體論與信號通路分析 利用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數據庫對DEGs進行基因本體(Gene Ontology,GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析(FDR<0.05,P值<0.05認為有統計學意義)。

1.4 蛋白互作網絡分析、Hub基因篩選 利用基因、蛋白質相互作用關系String(https://string-db.org/)數據庫在線分析DEGs的蛋白質—蛋白質相互作用(Protein-protein interaction,PPI)。借助Cytoscape 3.7.2軟件可視化PPI網絡圖，通過CytoHubba插件的MNC算法獲取得分最高的前10個基因(Hub基因)。

2 結果

2.1 DEGs的篩選結果 本研究選擇基因轉錄譜芯片GSE73338，以校正后Padj<0.01,|log2FC|≥2為篩選標準篩選出胰島素瘤相關DEGs共319個，其中包括140個上調基因和179個下調基因。然后以logFC為橫坐標，以校正后P值的負對數-log10(adj.P.Val)為縱坐標，對DEGs進行可視化，得到火山圖(圖1)。

圖1 胰島素瘤DEGs的火山圖

2.2 GO、KEGG分析 GO分析結果顯示，DEGs在生物過程中主要涉及炎癥反應、細胞對TNF/IL1反應、細胞增殖負調控、中性粒細胞趨化正調控、細胞遷移的正調控，分子功能主要涉及蛋白質結合，細胞組成主要在細胞表面和細胞外隙。KEGG通路富集分析結果顯示，DEGs主要涉及TNF信號通路、細胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號通路、類風濕關節炎、非洲錐蟲病和瘧疾。見表1。

2.3 PPI分析、Hub基因結果 DEGs編碼蛋白的PPI網絡圖中(已排除其中孤立的蛋白質，“可信度”為0.4)，共包含節點蛋白 314個，邊 741條(圖2)。

圖2 DEGs的PPI網絡圖

表1 胰島素瘤中DEGs的GO分析和KEGG分析

依據MNC算法得分前10位基因為白介素-6(Interleukin 6,IL6)、CXC趨化因子配體8(Cysteine X chemokine ligand 8,CXCL8)、白介素-1β(Interleukin 1 beta,IL1β)、β-淀粉樣蛋白(Amyloid beta A4 protein, APP)、單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1/CCL2)、CD44(Cluster of differentiation 44)、巨噬細胞炎性蛋白-3α[chemokine (C-C motif )ligand 20,CCL20]、CXC趨化因子配體2(Cysteine X chemokine ligand 2,CXCL2)、細胞間黏附分子-1(Intercellular adhesion molecule-1,ICAM1)、血管內皮細胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM1),見圖3。

圖3 MNC算法中排名前10名的基因

3 討論

pNEN是源于胰腺多能神經內分泌干細胞的一類腫瘤，依據激素分泌及相關臨床癥狀出現與否，pNEN可分為功能性和無功能性胰腺神經內分泌腫瘤(Functional pNEN,F-pNEN；Non-functional pNEN,NF-pNEN)，其中大部分pNEN是NF-pNEN。目前關于pENE的發病機制研究多集中于NF-pNEN,而F-pNEN有著其獨特的遺傳機制。一項對胰島素瘤患者進行全外顯子測序的研究發現胰島素瘤常出現正常拷貝數變異(Copy number variation, CNV)和擴增CNV，而CNV正常的胰島素瘤表現出較高的轉錄因子YY1(Yin-Yang1,YY1)基因突變率[3]。目前胰島素瘤的病因目前仍不清楚，本研究通過挖掘胰島素瘤患者胰島組織基因芯片數據，有助于胰島素瘤發病機制研究。

本研究通過GEO2R對GSE73338數據集進行數據挖掘，篩選出319個DEGs,包括140個上調基因和179下調基因。GO分析提示DEGs主要分布在細胞表面、外隙中，在蛋白質結合、炎癥反應、細胞對TNF/IL1反應等生物過程中顯著富集。KEGG分析顯示DEGs主要參與TNF信號通路、細胞因子受體相互作用、NOD樣受體信號通路等相關信號通路。接著構建了DEGs編碼蛋白間的PPI網絡圖并利用Cytoscape軟件cytohubba插件篩選出10個Hub基因，包括IL6、CXCL8、IL1β、APP、CCL2、CD44、CCL20、CXCL2、ICAM1、VCAM1，但這些基因在胰島素瘤的發生發展機制中的作用尚未研究。

慢性炎癥與許多腫瘤發生、發展密切相關，這主要是因為腫瘤微環境的形成。腫瘤微環境由單核細胞等炎癥細胞、多種細胞因子(趨化因子、黏附因子、炎癥因子等)和細胞外基質等元素組成，其在瘤細胞形成、腫瘤浸潤與轉移、耐藥性誘導等諸方面發揮重要作用[4]。作為介導炎癥反應的重要成員，細胞因子(Cytokine,CK)在免疫調節、炎癥應答、細胞增殖生長、腫瘤演進等生理或病理進程中發揮著舉重若輕的作用。CK是由多種細胞(主要是單核、巨噬細胞、T細胞等免疫細胞)經絲裂原等刺激后分泌的小分子蛋白物質的統稱，從其發揮的生物學功能角度，CK可分為白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、趨化因子等等。其中的趨化因子根據結構的不同又可以分為C、CC、CXC和CX3C四個亞族。白細胞介素-1β/6/8 (IL1β/6/8)在其中是比較重要的促炎細胞因子。IL1β是白介素-1家族中的一員，主要是由單核細胞產生，在大多數腫瘤(乳腺癌、結腸癌、黑色素瘤、肺癌等)中表達上調，通過激活MAPK和NF-KB信號轉導通路發揮促炎、促腫瘤生長和轉移等功能[5]。IL6可由IL1β和腫瘤壞死因子激活，它不僅是TNF信號通路的參與者，同時也在JAK/STAT和MAPK通路活化中起到關鍵作用，而IL6/STAT3通路對胰腺疾病進展具有調控作用[6]。CXCL8是腫瘤微環境內的顯著調節因子，常常被稱為IL8，不僅可以直接作用腫瘤細胞使其增生，同時還參與腫瘤血管生成、阻滯細胞凋亡、促細胞間及細胞和基質間黏附等促進腫瘤發生發展甚至轉移[7]。研究發現CXCL8在結直腸癌、黑色素瘤、甲狀腺癌等腫瘤中高表達，同時還能預示胰腺癌患者預后[8]。簡而言之，IL1β、IL6/8在腫瘤組織中的表達水平明顯高于正常組織，這與腫瘤的分期和浸潤轉移程度相關。而CCL2和CCL20都是趨化因子CC亞族中的成員，其中CCL2通過結合CC類趨化因子受體2募集單核細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞，從而參與炎癥和腫瘤的發生發展。已有研究表明CCL2在乳腺癌、結腸癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中高表達，且與腫瘤分級、轉移及浸潤程度密切相關[9]。CCL20，它是通過結合細胞表面的CCR6發揮信號傳導作用。Rubie C等檢測慢性胰腺炎、胰腺囊腺瘤、胰腺癌組織中CCL20的表達情況，結果發現CCL20在胰腺癌中顯著高表達[10]。本研究中發現在胰島素瘤組織中IL1β、IL6/8、CCL2和CCL20表達水平顯著下調，這可能是因為納入的標本幾乎都是良性胰島素瘤組織。

APP是一種具有多種生物學功能的跨膜蛋白，除了因酶活性障礙導致β-淀粉樣蛋白在大腦中過度沉積促使阿爾茲海默癥的發生，研究證明它也能介導細胞間或細胞與基質間的粘連作用。已有研究發現APP在胰腺癌細胞及其細胞上清中高表達[11]。ICAM1和VCAM1都是比較重要的細胞黏附因子，隸屬于免疫球蛋白超家族的成員，可以通過介導腫瘤細胞與細胞外基質的黏附促進腫瘤細胞侵襲和轉移。正常情況下在血管內皮表達量很低，而在腫瘤細胞中呈現高表達[12-13]。CD44有標準型CD44s和變異型CD44v兩種形式，前者主要在造血細胞、基質細胞中表達，后者在上皮和腫瘤細胞中表達。CD44通過與透明質酸結合促進細胞間及細胞與基質黏附，研究表明CD44與腫瘤發生、侵襲及轉移密切相關[14]。CD44、APP、ICAM1和VCAM1基因均參與細胞間或細胞與基質間的黏附過程，但其可能在胰島素瘤發生發展甚至惡變進程中發揮重要的作用，具體作用機制還需進一步驗證。

查閱PubMed等相關數據庫，截至2021年1月12日，對GSE73338基因芯片進行數據挖掘的文獻有2篇，1篇來自中山大學第一附屬醫院團隊[15]，他們分別對WHO不同分級的pNEN、良惡性的pNEN、轉移與否的pNEN和伴隨MEN1基因突變與否的pNEN進行了生物信息學分析，主要是探討pNEN的分期分級、侵襲和轉移背后的分子機制。另一篇則來自湖北省十堰市太和醫院[16]，他們對GSE7338中17個胰島素瘤和8個胰腺組織進行了差異基因篩選、GO、KEGG分析、Hub基因篩選，共獲得了1 632個DEGs(1 117個上調、514個下調)，分析發現上調DEGs與胰島素分泌密切相關，下調差異基因富集于胰腺分泌，同時發現7個Hub基因，分別是：GCG、GCGR、PLCB1、 CaSR、 F2R 、GRM1和GRM5。該研究所得差異基因數量眾多，富集分析，Hub基因篩選和本研究結果不一致，主要是因為它納入的8個胰腺組織包含本研究的3個正常胰島對照，對照不同，研究結果自然有差異。本研究可與之互為補充，從而更好地理解胰島素瘤的發生機制。

綜上，本研究通過生物信息學對GEO數據庫中胰島素瘤相關基因數據集進行挖掘，篩選出319個DEGs并對它們進行GO、KEGG和PPI分析，最終篩選出10個核心基因，但要想明確它們在胰島素瘤發病機制中的作用還需要臨床資料結合免疫組化等實驗的進一步驗證。